蒙古沙冬青外向钾离子通道AmGORK启动子克隆及表达分析

2021-11-19李俊林张焕朝聂文婧张海洋王向誉郭洪恩韩蕾

生物技术通报 2021年10期

李俊林张焕朝聂文婧张海洋王向誉郭洪恩韩蕾

（1. 山东省蚕业研究所，烟台 264002；2. 南京林业大学，南京 210037；3. 鲁东大学，烟台 264025）

植物启动子在基因的表达调控中起关键作用，基因表达的时空特异性、组织特异性和条件特异性主要取决于基因的启动子。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，能够在转录水平上参与并调控下游相应基因表达，使植物能够抵御外界各种环境胁迫［1-2］。因此，研究植物启动子有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。

干旱条件下，植物体内ABA水平升高，保卫细胞中的离子从细胞质膜运出，从而驱使气孔关闭，减少蒸腾失水［3-4］。保卫细胞外向整流钾离子通道（guard cell outward rectifying K+channe，GORK）是拟南芥保卫细胞唯一一个介导钾离子外流的钾离子通道，在气孔关闭过程起重要作用［5-7］。拟南芥GORK在保卫细胞、根及维管组织中表达，在转录水平上受干旱、盐和冷胁迫诱导［8］。在保卫细胞中，GORK的表达与分布对ABA不敏感，但其分布受细胞外钾浓度影响［7-8］。但是，ABA对保卫细胞外向整流钾通道转运钾离子有直接调控作用［9］。GORK也可通过蛋白磷酸酶（PP2C-type protein phosphatase，PP2CA）介导的信号途径增强拟南芥对ABA的敏感性，并对高盐和渗透胁迫的相关机制起到了负调节作用［10］。GORK通道可以作为细胞代谢的“主开关”，调节细胞内K+稳态以适应环境条件的变化，从而最大限度地发挥植物的适应潜力［11］。迄今为止，除了拟南芥GORK，Li等［12］曾报道蒙古沙冬青中一个与拟南芥GORK同源的外钾离子通道AmGORK，该通道与拟南芥GORK电生理功能特征相似，但其体内生理功能还未有报道。

蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）为豆科，沙冬青属，是我国西北荒漠区特有的常绿旱生阔叶灌木，起源与第三纪，濒危物种，国家三级保护植物［13-14］。常年生长在年降水量不足100 mm，年蒸发量大于3 000 mm的极端干旱环境中，是研究植物抗旱机制的很好材料［15］。

本研究从蒙古沙冬青中克隆了外向钾离子通道AmGORK的启动子序列，利用PlantCARE预测AmGORK启动子顺式作用元件。将AmGORKpro定向替换植物表达载体Cambia1301的CaMV35S启动子，构建重组载体Cambia1301-AmGORKpro-GUS，通过转基因技术转入野生型拟南芥。组织化学染色和定量分析揭示该启动子对干旱胁迫的响应特性，为深入研究该基因在水分及养分利用、光合作用、抗旱等过程的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（A. mongolicus）由甘肃民勤沙生植物园提供。拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚（Columbia）野生型和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101为海水农业实验室保存。大肠杆菌（Escherichia coli）Trans1-T1、Taq酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取利用CTAB法提取蒙古沙冬青幼嫩叶片基因组DNA，微量紫外分光光度计检测DNA质量和浓度，-20℃保存备用。

1.2.2 AmGORK基因5′侧翼片段克隆鉴于AmGORK启动子序列未知，参考Liu等［16］的方法进行交错式热不对称PCR法（thermal asymmetric interlaced PCR），以沙冬青基因组DNA为模板，根据前期已经克隆得到的AmGORK序列，分别在其DNA序列ATG下游45、114和248 bp处设计3条反向引物GP1-3、GP1-2和GP1-1。为了增加PCR反应特异性，在GP1-2引物前添加一段随机引物序列。合成4条随机引物LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3和LAD1-4以及1条引物AC1，具体序列见表1。

AmGORK的5′侧翼片段的扩增由3轮PCR完成，第一轮PCR反应以沙冬青基因组DNA为模板，上游引物分别是4条随机引物，下游引物是GP1-1；首轮PCR产物稀释40倍后作为第二轮PCR反应模板，上游引物为AC1，下游引物为GP1-2；第二轮PCR产物稀释10倍后作为第三轮PCR反应模板，上游引物为AC1，下游引物为GP1-3。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将PCR条带切胶回收，与pMD19-T载体连接，送华大基因测序。根据测序结果设计引物（GP2-1、GP2-2和GP2-3），用同样方法进行PCR扩增，直到获得需要大小的目的片段。

1.2.3 AmGORK启动子的克隆及鉴定根据上述测序得到的DNA拼接序列设计上游引物AmGORK-pro-F和下游引物AmGORK-pro-R（表1），并分别在引物5′端引入KpnⅠ和NcoⅠ酶切位点。

表1 试验所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

以沙冬青基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖电泳检测。按照回收试剂盒说明书回收目的片段。获得的目的片段和pEasy-blunt zero载体（TransGen Biotech）连接，并转化Trans1-T1，涂在含氨苄的平板上，挑取菌斑做菌落PCR鉴定，初步确认为阳性克隆后，送华大公司测序。测序结果正确，含有AmGORK启动子重组质粒，保存待用。

1.2.4 AmGORK启动子序列的特征分析通过在线软件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测分析［17］。

1.2.5 AmGORK启动子植物表达载体的构建用KpnⅠ和NcoⅠ分别对上述测序正确的含有AmGORK启动子重组质粒和植物表达载体pCambia1301-GUS进行酶切、片段回收、纯化、连接及阳性克隆鉴定（图 1）。

图1 表达载体构建示意图Fig.1 Construction map of expression vector

1.2.6 AmGORK启动子转化拟南芥根据农杆菌介导的花序侵染法，将Cambia1301-AmGORKPro-GUS转化拟南芥。将收获的T0代种子播种于含有50 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基中，选取能够长出绿色真叶，根系较长的抗性苗移栽到基质中。

1.2.7 GUS组织化学染色参考Han等［18］的方法，选取T3代纯合转基因拟南芥的不同组织置于GUS染色液中，37℃黑暗培养过夜，用梯度浓度酒精完全脱色，显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 AmGORK启动子的克隆

AmGORK的5′侧翼片段的扩增由3轮PCR完成（图2-A），获得约1 200 bp的序列。然后根据测得序列重新设计3条引物GP2-1、GP2-2和GP2-3（表1），继续向5′侧翼延伸（图2-B）获得500 bp左右的序列。将2次测得的序列拼接，删除中间重复片段，得到长度为1 723 bp的序列，命名为AmGORKpro。

图2 AmGORK启动子序列的扩增Fig. 2 Amplification of AmGORK promoter sequence

根据上述拼接序列设计上游引物AmGORK-pro-F和下游引物AmGORK-pro-R，分别在引物5′端引入KpnⅠ和NcoⅠ酶切位点。以沙冬青基因组DNA为模板，进行PCR扩增（图2-C），得到2条约1 700 bp的特异条带。将上述片段与pEasy-blunt zero载体（TransGen Biotech）连接，转化Trans1-T1，进行菌落PCR鉴定，初步确认为阳性克隆后测序。将测序结果正确含有AmGORKpro的重组质粒保存待用。

2.2 AmGORK启动子序列功能预测分析

利用在线数据库PlantCARE对AmGORK启动子序列的结构特征及重要的顺式作用元件进行分析。结果（表2）显示，AmGORK启动子序列包含典型的TATA-box及CAAT-box。此外，还包含ABA响应元件ABRE、赤霉素响应元件GARE、干旱诱导元件MBS、低温响应元件LTR等各1个，及多个光响应元件。表明AmGORK可能受到干旱、低温等非生物胁迫或光信号的调控。

表2 AmGORK启动子序列预测分析Table 2 Prediction analysis of AmGORK promoter sequence

2.3 转基因拟南芥植株的鉴定

根据农杆菌介导的花序侵染法，将Cambia1301-AmGORKPro-GUS转化拟南芥。将收获的T0代种子播种于含有潮霉素的1/2 MS培养基中，提取能够长出绿色真叶，根系较长的抗性苗基因组DNA，进行PCR检测（图3），抗性植株的PCR产物与目的条带大小一致。初步证明目的基因已成功转入拟南芥中。按照上述方法获得T3代纯合转基因株系。

图3 转AmGORK拟南芥PCR鉴定结果Fig. 3 PCR validation of AmGORK transgenic A. thaliana

2.4 AmGORK启动子的组织表达特异性

构建了Cambia1301-AmGORKpro-GUS植物表达载体，通过农杆菌介导，将该表达载体转入拟南芥中，观测转基因阳性植株GUS的表达情况（图4），转基因拟南芥的叶片叶柄、叶脉、保卫细胞和茎均有明显的蓝色GUS染色信号，表明AmGORK的表达在整个发育阶段具有连续性。除了叶片，在主根中柱和花萼也有GUS的表达，表明AmGORK的表达具有组织特异性，并且主要在输导组织中表达。

图4 转基因拟南芥中AmGORK启动子活性分析Fig.4 Activity analysis of AmGORK promoter in transgenic A. thaliana

2.5 逆境胁迫对转基因幼苗AmGORK启动子活性的影响

为了研究非生物胁迫对拟南芥中AmGORK启动子活性的影响，对转AmGORK启动子的拟南芥进行PEG或ABA处理。定量表达分析显示，PEG处理24 h后，转基因植株叶片的GUS表达为对照的3.2倍，ABA处理24 h后，转基因植株叶片的GUS表达为对照的4.1倍（图5）。以上结果表明，AmGORK启动子活性受PEG或ABA诱导。

图5 不同处理下转基因拟南芥叶片中GUS的表达分析Fig. 5 Expression analysis of GUS gene in the transgenic A. thaliana leaves under different treatments

3 讨论

启动子位于基因上游，被RNA聚合酶特异性识别并结合的一段DNA序列，在转录水平，对基因的表达起调控作用。启动子核心区域一般包括TATA-box和CAAT-box等模块，这也是启动子的特征序列［19-20］。本研究通过生物信息学对克隆的AmGORKpro序列进行分析，发现该序列含有多个TATA-box和CAAT-box，说明该序列具有典型的启动子特征。除了这些核心特征序列外，启动子中还有很多特异的顺式作用元件和非生物胁迫响应元件［21-22］。研究结果显示，AmGORK启动子序列内包含干旱响应相关元件、激素响应元件和光响应元件等。启动子区域的干旱诱导响应元件、ABA响应元件和水杨酸响应元件与基因参与的逆境响应和对应激素信号转导有关，而ABA和水杨酸介导植物对外界环境的响应［23-25］。

拟南芥中2个外向型钾离子通道分别为中柱钾离子外向整流通道（stelar K+outward rectifier channel，SKOR）和GORK，SKOR主要在根中柱鞘和中柱薄壁细胞中表达［26］。GORK主要在保卫细胞中表达，进一步研究发现其在根、叶、花和花粉中都有表达［6，8］。本研究结果显示，AmGORK组织定位模式与拟南芥GORK基本一致，都在根中柱、叶脉、叶柄等输导组织中表达。输导组织是植物体中担负物质长途运输的主要组织，根从土壤中吸收的水分和无机盐分，由输导组织运送到地上各个部位。植物组织间的物质重新分配和转移，也要通过输导组织来进行。AmGORK在输导组织中表达，推测其可能参与植物水分或养分运输与再分配过程。此外，AmGORK启动子还存在数个“TAAAG”元件，这些元件能够驱动马铃薯钾通道KST1在保卫细胞中特异性表达［27］，同时，AmGORK在保卫细胞中有强烈的GUS信号，表明AmGORK可能参与保卫细胞运动过程。植物遭遇干旱胁迫时，体内ABA含量提高，ABA通过激活保卫细胞内Ca2+、K+及阴离子通道，使保卫细胞内离子外流，减少保卫细胞渗透压，导致气孔关闭，从而适应水分亏缺［28-29］。蒙古沙冬青幼苗受到PEG模拟水分胁迫及ABA处理2 d后，都能引起AmGORK表达上调［12］，有报道显示，拟南芥外向整流钾离子通道AtGORK受到干旱胁迫时，表达量也上调［8］，表明AmGORK可能参与干旱胁迫引起气孔关闭过程。