非洲菊GjMnSOD基因的克隆及表达分析

武欢 卢珍红 郝向阳 王斌 焦元辰 杨春梅 程春振，4

（1. 福建农林大学园艺学院，福州 350002；2. 云南省农业科学院花卉研究所，昆明 650100；3. 玉溪云星生物科技有限公司，玉溪 652604；4. 山西农业大学园艺学院，太谷 030801）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物防御系统的关键酶，可高效清除生物体内超氧化物阴离子、过氧化氢和羟基自由基等物质［1-2］。它还可以通过诱导其他一些抗氧化酶的活性，在有机体维持自由基动态平衡过程中发挥重要作用［3］。所有SOD的催化中心都含一个金属离子，根据金属辅基的差异，SOD家族可分为Cu/ZnSOD、FeSOD、MnSOD和NiSOD等4类［4］。其中，Cu/ZnSOD在植物中分布最广、稳定性最高，可提高植物的耐盐性［5］。FeSOD仅存在于叶绿体中，热稳定性高［6］，参与调控植物的抗寒性及抗氧化能力［7-8］。与前两种SOD不同，MnSOD主要是诱导型表达［9］，广泛参与植物的抗逆防御，与旱生植物耐旱、耐盐能力密切相关［10］。此外，MnSOD和FeSOD具有很高的相似性，可能起源于共同的祖先基因［11］。与FeSOD类似，MnSOD对植物抗寒性的也有促进作用［12］。而Ni-SOD是最近从土壤微生物和蓝细菌分离获得的一种SOD，与其他SOD相似性较低［4，13］，目前在植物中尚未见报道。

鉴于SOD在植物抗逆防护反应中的重要作用，人们对编码SOD的基因展开了大量研究［14］。自1982年科学家从玉米中克隆获得了SOD基因后［15］，众多单子叶和双子叶植物SOD基因被陆续克隆获得［16］。多项研究显示：提高SOD基因的表达可赋予植物抵抗多种非生物胁迫的能力。如过表达南瓜SOD的拟南芥，其冷诱导基因和干旱响应转录因子的表达显著升高，抗低温和干旱能力得到明显增强［17］。过表达花生Cu/ZnSOD的烟草对盐胁迫和干旱胁迫的抗性显著提升［11］。还有研究指出过表达MnSOD 可提高烟草［18］、小麦［19］和紫杆柽柳［20］等植物的抗盐性。

非洲菊（Gerbera jamesonii）作为世界五大鲜切花之一，具有极高的商业价值［21］。目前有关非洲菊SOD基因的研究较少。在本研究中，我们从实验室前期获得的非洲菊转录组中筛选获得一个包含完整ORF的SOD基因序列，使用反转录PCR克隆获得该基因并对其进行了系列生物信息学分析，同时还研究了该基因在IAA、SA和GA3等激素处理和盐、干旱和低温等非生物胁迫处理下的表达模式，以期为揭示该基因的功能及其在非洲菊抗逆育种中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用非洲菊品种‘玲珑’由云南省农业科学院花卉研究所提供。选取生长状态良好、长势一致、株高约为30 cm的植株，取根、叶柄和叶片用于 RNA 提取［22］。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 IAA、GA3和SA等3种激素（浓度均为 100 μmol/L）和盐胁迫（200 μmol/L NaCl）处理参照孙雪丽等［23］的方法，于处理0 h、2 h、4 h、8 h、24 h和48 h取叶片。干旱胁迫（30% PEG-3000）处理参照郝向阳等［24］的方法，由于PEG模拟干旱处理植株显症时间较早，因此选择于处理后0 h、1 h、2 h、4 h和6 h取叶片。4℃低温处理参照王星淇等［25］的方法，于处理后0 h、4 h、8 h、12 h和24 h取叶片。所有样品取样后立即置于液氮中速冻，之后置于-80℃保存备用。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 利用Trizol RNA提取试剂盒（TaKaRa）提取非洲菊叶片总RNA。采用RevertAid第一轮cDNA 合成试剂盒（thermo scientific）合成cDNA第一链，用于基因全长克隆。同时采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removel）试剂盒（全式金）逆转录合成不同处理样品的cDNA用于qRT-PCR试验。

1.2.3 SOD基因克隆及测序验证 根据本实验室前期获得的非洲菊转录组数据，设计基因特异性引物（上游引物序列为：ATGGCTCTTCGAACCCTAG，下游引物序列为 ：TTAAGGGCACTCTTTCTC）。25 μL PCR 反应体系包括：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2X）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL 和上下游引物各1 μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，45个循环；72℃延伸10 min。所得PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。采用Gel/PCR Extraction Kit回收目的片段，连接到PMD 18-T载体后转化DH5α感受态，经菌液PCR鉴定后选取阳性克隆送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序验证。

1.2.4 生物信息学分析 参照郝向阳等［24］的方法，利用在线软件分析GjMnSOD蛋白基本理化性质、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、蛋白二级结构以及保守结构域。分别使用在线工具分析前导肽（https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html）、蛋白保守基序（http：//meme-suite.org/）和三维结构（https：//swissmodel.expasy.org/）。从 NCBI数据库中检索并下载其他物种MnSODs的氨基酸序列，使用MEGE-X邻近归并法（neighbor-joining method）构建系统进化树。

1.2.5 SOD基因表达分析 以稀释50倍的cDNA为模板，以非洲菊18S rRNA为内参基因，在Roche Lighcycler 480荧光定量PCR仪上进行定量分析。qRT-PCR扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃变性10 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共45个循环。qRT-PCR反应体系包含SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）荧光染料 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各 1 μL 和 cDNA 1 μL［24］。使用 2-△△CT法计算其不同处理下GjMnSOD相对表达量［26］。利用SPSS软件分析不同样品和处理间的差异显著性，使用Excel 2016作图。

2 结果

2.1 SOD基因克隆验证及序列分析结果

成功从非洲菊品种‘玲珑’中克隆获得了一条789 bp的基因序列（图1）。序列分析结果显示，该基因的CDS长度为519 bp，预测可编码172个氨基酸。BLASTn序列比对结果显示该基因与其他物种MnSOD同源性较高。其中，与刺苞菜蓟MnSOD基因序列同源性高达91.27%，与紫花苜蓿MnSOD基因序列同源性达90.45%，推测该基因是一个MnSOD基因（命名为：GjMnSOD，GenBank登录号为 MH708534.1）。

图1 cDNA扩增产物电泳检测结果Fig. 1 Electrophoresis detection result of cDNA amplification products

2.2 GjMnSOD基因编码蛋白理化性质分析

分析结果显示：GjMnSOD的编码蛋白为稳定的亲水蛋白，分子量为19 203.85，分子式为C862H1346N238O252S4，原子总数为2 702，不稳定系数23.52，脂肪系数为82.79，等电点7.93；该蛋白由19种氨基酸组成，其中亮氨酸（Leu）和赖氨酸（Lys）含量最多，均占9.3%；其次为丙氨酸（Ala），占8.1%。含有带正电荷残基总数（Ary+Lys）20个和带负电荷残基总数（Asp+Glu）19个。磷酸化位点预测显示，该蛋白中仅有4个磷酸化位点：酪氨酸（17thaa、19thaa），苏氨酸（7thaa）和丝氨酸（18thaa）（图2-A）。

GjMnSOD无跨膜结构、信号肽及线粒体前导肽结构，推测属于非分泌性蛋白。通过分析其保守结构域，发现该蛋白含有SodA（位于1-164 aa间）和Sod-Fe-C（位于70-164 aa间）保守结构域和非特异性保守结构域PLN02471（位于1-160 aa间，图2-B），属于MnSOD家族。亚细胞定位预测结果显示GjMnSOD主要定位于线粒体，与前人报道的植物MnSODs主要定位于线粒体或过氧化物酶体的结论相符。

图2 GjMnSOD蛋白磷酸化位点及保守结构域预测结果Fig.2 Prediction of GjMnSOD protein phosphorylation site and conserved domain

2.3 保守基序预测及蛋白结构分析结果

GjMnSOD二级结构由44.19% 的α螺旋、30.18% 的无规则卷曲、8.14% 的β-转角和16.86%的延伸片段构成（图3）。MEME预测结果显示，GjMnSOD包含11个保守基序（表1）。以拟南芥中锰超氧化物歧化酶的晶体结构（与GjMnSOD相似度达78.70%）作为模板进行SWISS-MODEL同源建模，发现该蛋白金属结合位点为His4、His52、Asp141和 His145（图4）。

图4 GjMnSOD三级结构Fig. 4 Predicted tertiary structure of GjMnSOD

表1 GjMnSOD蛋白保守基序Table 1 GjMnSOD protein conserved motif

图3 GjMnSOD二级结构预测结果Fig. 3 Prediction of secondary structure of GjMnSOD

2.4 GjMnSOD蛋白质序列比对及系统进化分析结果

蛋白质序列比对结果（图5）显示，GjMnSOD与刺苞菜蓟、紫花苜蓿及莴苣等植物的MnSODs相似度较高，且 C端序列更为保守。GjMnSOD在141-148位氨基酸之间含有一个MnSOD特征序列（DVWEHAYY），再次说明其属于MnSOD。GjMnSOD与刺苞菜蓟（Cynara cardunculus）MnSOD（XP_024979965.1）相似度最高，达93.86%。与紫花苜蓿、莴苣和向日葵MnSOD相似度也均高于92%，相似度分别为93.45%、92.58%和92.54%。进化树分析结果也显示非洲菊GjMnSOD与刺苞菜蓟（Cynara cardunculus）MnSOD（XP_024979965.1）亲缘关系最近（图6）。此外，非洲菊GjMnSOD与莴苣、向日葵、刺苞菜蓟和黄花蒿等菊科植物MnSODs聚在一支，木薯、海榄雌和松蒿MnSODs聚为另一支。

图5 不同植物MnSOD蛋白序列多重比对结果Fig. 5 Multiple alignment results of MnSOD proteins from different plants

图6 非洲菊GjMnSOD与其他植物MnSOD系统进化树Fig. 6 Phylogenetic tree of GjMnSOD in G. jamesonni and MnSOD proteins from other plants

2.5 实时荧光定量PCR结果

在IAA、GA3和SA等3种激素处理下，GjMnSOD相对表达量均显著下调（图7-A-C）。其中，IAA处理后下调最为明显，在处理初期相对表达量即极显著降低，处理12 h时达到最低值；GA3处理后，GjMnSOD相对表达量显著下降，24 h时有所回升但仍显著低于对照；SA处理后，GjMnSOD相对表达大致呈逐步降低的趋势，24 h时仅约为对照组1/3。

盐胁迫处理下，GjMnSOD表达受到抑制，呈“降-升-降”趋势，处理4 h后相对表达量降为对照的2/5，8 h时表达量有所回升，但仍显著低于对照，之后表达量显著下降，并于24 h时达到最低值（图7-D）。

在30% PEG模拟干旱胁迫下，GjMnSOD相对表达量呈现出“先降后升”的趋势。处理1 h和2 h时，表达量显著低于对照，4 h时显著高于对照，并于6 h时达到最大值，约为对照组2.3倍（图7-E）。

4℃低温处理下，GjMnSOD基因的表达受到极显著抑制（P＜0.01），低温处理后各时间点的表达量均不足对照组1/5（图7-F）。

图7 激素与非生物胁迫处理对GjMnSOD相对表达量的影响Fig. 7 Effects of hormone and abiotic stresses on the relative expression of GjMnSOD

3 讨论

本研究成功从‘玲珑’非洲菊克隆获得了一个SOD基因，其编码蛋白具有经典MnSOD的特征序列及保守结构域，与刺苞菜蓟MnSOD相似度最高且亲缘关系最近，亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位于线粒体，由此推断其属于线粒体MnSOD（命名为GjMnSOD）。此外，本研究还发现GjMnSOD的表达受多种激素和非生物胁迫处理影响显著。

3.1 GjMnSOD的表达受激素影响显著，可能在非洲菊激素稳态调节中发挥重要作用

研究表明，MnSOD基因的表达受激素含量和外源激素处理影响显著［27］。如小麦CsMSD基因随GA3处理时间的延长，表达水平逐步升高，并于48 h时达到峰值［28］；芥菜 BjMnSOD 受 SA 显著诱导［29］；在IAA、GA3和SA处理下，香蕉MaMSD的表达均随着处理时间延长而上调［30］。但也有一些MnSOD基因的表达受激素抑制，如番茄SlSOD7基因启动子区虽然含有SA应答元件TCA-element，但在SA处理下表达水平明显下调［13］；龙眼DlMSD的表达也受GA、IAA和SA显著抑制［31］。本研究中，在IAA、GA3和SA等3种激素处理下，GjMnSOD基因的表达均显著降低，暗示GjMnSOD在非洲菊激素稳态调节中发挥作用。

3.2 GjMnSOD参与非洲菊对多种非生物胁迫的响应

超氧化物歧化酶是一类金属酶，MnSOD的表达受金属离子影响显著［14］。徐龙［32］的研究发现茄子SmMnSOD在0.15 mol/L NaCl处理6 h时的表达量约为对照的3.02倍。朱磊等［29］发现芥菜BjMnSOD的表达受150 mmol/L NaCl显著诱导，处理36 h时表达量高达对照组的8.7倍。程华等［33］发现100 mmol/L NaCl处理后银杏GbMnSOD的转录表达量明显提升，约为对照组3.5倍。而刘家林等［34］发现水稻OsSOD7受盐胁迫影响并不显著，说明MnSOD在不同植物响应盐胁迫过程中发挥的作用可能不同。本研究发现，GjMnSOD受NaCl胁迫显著抑制，在处理8 h时表达量有所回升，说明其参与非洲菊抗盐反应。

MnSOD与植物耐旱性息息相关［10］。研究发现不同植物MnSOD在干旱胁迫下的表达模式差异显著。白三叶草MnSOD的表达在干旱胁迫12 h时表达量达到最大值［35］。而茄子SmMnSOD受干旱（20% PEG）诱导表达不显著，仅在48 h时略高于对照［36］。本研究发现，GjMnSOD在30% PEG模拟干旱处理4 h时，其相对表达量极显著高于对照组，6 h时表达量进一步升高，约为对照组的2.3倍，说明GjMnSOD在非洲菊遭受干旱胁迫4 h后表达量即出现显著升高，从而在非洲菊抵御干旱过程中发挥重要作用。

MnSOD在植物抗寒反应中发挥着重要作用。Li等［37］发现莲花NnMSD1在低温诱导过程中表达量显著高于对照，于24 h时达到峰值，约为对照8.6倍。曾小玲等［38］发现菜心BclMSD在低温处理下表达量呈“升-降”趋势，处理6 h时在根中的表达量最高。而茄子SmMnSOD在低温胁迫下表达量呈现急剧下降趋势，处理3 h时表达量仅约为对照的20%［37］。苜蓿MtMSD基因在低温胁迫24 h时的表达也受到显著抑制［39］。本研究中，GjMnSOD的表达受低温胁迫抑制显著，与隽加香等［40］研究番茄线粒体中的SOD在低温胁迫下的结果相一致。前人研究表明，MnSOD活性与线粒体呼吸链的电子传递密切相关［38］，由此推测低温下非洲菊呼吸速率的降低可能是GjMnSOD基因表达被抑制的原因。

4 结论

本研究成功克隆获得一个非洲菊线粒体锰超氧化物酶基因GjMnSOD。该基因的表达受IAA、GA3、SA、盐胁迫和低温显著抑制，但受干旱显著诱导，说明作为一个线粒体SOD基因，GjMnSOD参与非洲菊激素和逆境胁迫响应，可能在非洲菊抵御干旱过程中发挥重要的正向调控作用。