淋巴细胞亚群对儿童EB病毒感染所致传染性单核细胞增多症的诊断意义

刘晓宇，王丹丹，呼婵娟，张俊红

EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）是疱疹病毒-4家族的成员之一[1]，是一种双链DNA，具有亲淋巴细胞性和亲上皮细胞性。是由Epstein.Barr首次在非洲儿童Burkitt淋巴瘤细胞中发现而得名[2]。是引起儿童传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）的最主要病原之一[3]。据流行病学调查显示[4]，人群对EBV普遍易感，大部分人初次感染EBV是在儿童或青少年时期。在感染潜伏期，EB病毒主要附着于B淋巴细胞中，此时B细胞并不表达EB病毒核蛋白，不具有致病性[5]。EB病毒感染后，B细胞释放出病毒颗粒，激活细胞毒性T淋巴细胞，释放大量炎性因子，EB病毒从潜伏状态变为增殖状态。炎性反应和免疫破坏协同作用可能是导致传染性单核细胞增多症预后不良的重要原因[6]。在不同免疫状态下，有不同的临床表现。感染发生后大多数人能通过机体对EBV特异的获得性免疫反应被控制为隐性感染，不发病。少数感染者会发生IM等急性感染表现，表现为发热、咽峡炎、淋巴结肿大等[7-8]。虽然大部分感染者呈自限性，预后良好。但仍有少数患儿病情会出现进展，发展为慢性活动性EBV感染、EBV相关噬血细胞综合征等[9]，导致不良预后，甚至危及患儿生命[10]。IM临床表现不典型，涉及全身各系统。有研究认为，EBV能导致T细胞介导的过度激活，导致免疫异常，病情发展与之密切相关。本研究检测IM患儿外周血淋巴细胞亚群变化，可能对及时诊断并掌握病情变化，为临床诊治提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2014年10月—2019年10月90例EBV感染致IM患儿作为病例组，男50例，女40例，年龄3～8岁，平均（5.7±1.4）岁；以年龄、性别配对的同期健康体检儿童80人作为对照组，男48例，女32 例，年龄3～9岁，平均（6.1±1.6）岁；2组儿童年龄、性别构成差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 评价标准 纳入标准：病例组儿童符合IM诊断标准[11]，对照组儿童为来本院行健康体检患儿，均无家族遗传性疾病史，或小儿无急慢性疾病史。排除标准：①免疫缺陷性疾病或自身免疫性疾病者；②先天性生理缺陷或先天畸形；③入院前2周使用免疫调节剂及糖皮质激素史；④淋巴癌、骨髓癌等恶性肿瘤。

1.3 IM诊断标准[11]符合以下6项临床指标中任意3项，同时符合实验室指标任意1项。临床指标：①发热；②颈淋巴结肿大；③咽、扁桃体炎；④肝大；⑤眼睑水肿；⑥脾大。实验室指标：①抗EBV-病毒衣壳抗原（VCA）-IgM与抗EBV-VCA-IgG抗体阳性，且抗EBV-核抗原（NA）-IgG抗体阴性；②抗EBV-VCAIgM阴性，但抗EBV-VCA-IgG抗体阳性，且为低亲和力抗体；③双份血清EBV-VCA-IgG抗体滴度4倍以上升高；④外周血淋巴细胞计数增多≥5.0×109/L，或异型淋巴细胞分数≥0.10。

1.4 检测方法 入组儿童均抽取清晨空腹静脉血各2 ml，一份经乙二胺四乙酸行抗凝处理 ，采用流式细胞仪检测外周血B淋巴细胞、CD3＋、CD4＋、CD8＋数量，通过CXP2.0 系统行图像分析。同时入组的患儿进行EB-DNA及EBV抗体的检测，协助诊断。EBV-DNA＞102为阳性。EBV-IgM检测正常范围0～3 AU/ml。

1.5 统计学处理 应用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，CD3＋、CD4＋、CD8＋数量等以±s表示，采用t检验，性别构成采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组外周血淋巴细胞亚群数量比较 病例组CD3＋、CD8＋数量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD4＋数量差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 2组外周血淋巴细胞亚群数量比较

2.2 临床症状 90例（100%）患儿均有不同程度发热，颈部淋巴结肿大，扁桃体炎。27例（30.8%）患儿以双眼睑浮肿为首发症状，伴有鼻塞，打鼾。9例（10%）患儿出现丘疹、斑丘疹。脾肿大比较常见13例（14.4%），一般肋下可触及。少数出现肝功能异常，白细胞减少。

3 讨论

EBV是淋巴细胞双链 DNA 病毒的一种[12]，传播途径主要是经唾液传播，人类是其唯一的自然宿主。儿童及青少年人群是EBV的主要易感人群[13]，病情进展多是在伴有遗传缺陷、免疫抑制或潜伏感染反复激活的情况下发生。EBV感染以呼吸道感染和IM为多见，临床可以表现为急性感染、肺炎、肝功能异常、甚至发展为慢性活动性EB病毒感染、噬血细胞综合征。典型传染性单核细胞增多症临床表现包括发热、咽扁桃体炎、颈部淋巴结肿大等。对于临床表现不典型的患儿IM的诊断和治疗增加了难度。此外肺炎支原体感染、巨细胞病毒感染也可以导致与IM相类似的临床表现：发热、颈部淋巴结肿大、咽峡炎三联征。而且一旦感染EBV，病毒会终生携带。所以早期诊断尤为重要。机体不同免疫状态感染EB病毒导致的IM的转归和预后存在较大差异。随着年龄的增长，人体免疫系统逐步完善，感染后增殖的细胞刺激淋巴细胞产生强烈应答。年长儿IM发病率较婴幼儿稍低，一般发展中国家儿童EBV感染有90%发生于6岁前[14]。

EBV主要感染B细胞，导致B细胞表面抗原发生改变，继而引发T细胞防御反应，CD4+T淋巴细胞是辅助T淋巴细胞，该细胞内分子发生磷酸化，激活信号转导过程，通过一些细胞因子、辅助B细胞、细胞毒T细胞、自然杀伤细胞等的激活，CD8＋T淋巴细胞就具有杀伤作用的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）[15]。有文献报道随着EB病毒感染的进展，携带EB病毒的B淋巴细胞在外周血中大量增殖，诱导机体固有的免疫应答，清除大部分EB病毒阳性B淋巴细胞[16]。部分逃避免疫攻击的B淋巴细胞分化成浆细胞，释放病毒颗粒，EB病毒感染发展为急性期，逐渐出现临床表现：发热、颈部淋巴结肿大、扁桃体炎、皮疹等。关于EB病毒逃避人体免疫攻击的可能机制：在人体特定部位进行复制；下调感染细胞表面的黏附因子或人类白细胞抗原分子；无法识别病毒主要免疫表位突变以及标为特异性细胞毒性T淋巴细胞，下调感染细胞中病毒基因的表达。

本研究观察外周血CD3＋、CD8＋水平，结果显示，病例组CD3＋、CD8＋数量明显高于健康对照组，差异有统计学意义。表明IM患儿CD3＋、CD8＋失衡，与祁正红研究结果一致[6]。这可能是儿童感染EBV后，过度激活免疫反应。患儿感染 EBV 后会在短时间内发生强烈的T淋巴细胞反应，机体内产生大量的T淋巴细胞[17]。所以病例组患儿CD3＋、CD8＋数量明显高于对照组。专家认为患儿CD3＋、CD8＋数量明显升高应注意严重并发症的发生及患儿重症IM发生的可能[18]。也有专家认为，CD8＋T 细胞升高可以杀灭被感染的B细胞，消灭大部分EBV，疾病得以控制，因而临床出现自限性过程[19]。CD4＋细胞不仅可以协助B细胞产生抗体，中和抗原，还能诱导CD8＋T 细胞发挥细胞毒作用。IM急性期时，患儿体内EBV特异性CD4＋细胞占血液循环1%左右，EBV特异性CD4＋产生细胞因子，进而影响EBV阳性B细胞增殖。与潜伏期比较，CD8＋T 细胞升高，通过分泌穿孔素直接杀伤感染EB病毒的B淋巴细胞。当患儿进入恢复期后，CD4＋细胞升高，CD8＋细胞 降低，表明机体免疫功能逐渐恢复正常，有效避免细胞因子大量分泌导致的过度免疫损伤[20]。

EBV进入口腔及咽部后，B淋巴细胞最先受到感染，使细胞表面抗原遭到破坏、变性后，病毒在B细胞内大量繁殖，继而累及全身淋巴组织及含淋巴细胞的组织，诱导T细胞的活化、增殖，同时两种CD8＋T细胞的平衡状态被打破，大部分CD8＋T细胞转变成细胞毒性T细胞，导致强烈免疫应答，引起机体免疫应答功能紊乱。同时在EBV感染的B淋巴细胞被溶解的过程中会分泌大量的炎性细胞因子，从而产生包括发热、咽痛、淋巴结肿大等一系列临床表现。而免疫低下者，缺乏这种免疫机制，导致病情难以控制，转变为慢性EBV感染，成年后甚至发展为鼻咽癌等[21]。

EBV-DNA的定量检测是诊断IM和监测EB病毒载量的一种有效方法尤其适用于出现相关症状但EBV血清学抗体阴性的患儿，并可排除其它病原导致的传染性单核细胞增多症。可以反映出体内EBVDNA感染和复制水平[22]。其敏感性达77%，特异性达99%。但是其检测技术复杂，价格较高，有很多基层医疗机构不具备检测条件，所以需结合其他检测方法。如果EBV-DNA为低载量，而无临床症状、体征，提示带病毒状态，不需要干预，但需定期随访。EBV的载量和病情的严重程度成正相关，临床可以根据EBVDNA定量来判断病情严重程度[23]。有研究观察到经治疗后EBV-DNA阴性的患儿，免疫功能也恢复正常。

人体感染EBV后可以产生抗-衣壳抗体（VCA）、早期抗体（抗EA）、EBV核抗体（扛EBNA）。其中各种抗体中，早期出现VCA-IgM，为近期急性感染的主要标志物；VCA-IgG一般提示既往感染；EA是病毒增殖的标志，抗-EA一般提示原发感染恢复期，也提示近期感染。抗EBNA出现较晚，一般于感染后数周。VCAIgM最具有诊断价值，一般提示急性感染期，有较高的特异性，在诊断不典型IM具有极其重要的意义[24]。

有研究发现CD3＋、CD8＋细胞数量增加与重症IM成正相关，与患儿病程和严重并发症有关[18]。免疫状态变化是患儿从感染发展到IM，慢性活动性EBV感染，并发间质性肺炎、心肌炎、血小板减少症、溶血性贫血等等。有专家建议对IM患儿进行定期随访，EB病毒与成年后的鼻咽癌、淋巴瘤有一定相关[25-26]。因此，检测免疫功能并做好EB病毒相关肿瘤的早期监测非常必要。

综上所述，EBV 感染致IM患儿CD3＋、CD8＋细胞数量增加，结合EBV-DNA的定量检测和抗体检测，有助于IM的准确诊断，并为治疗方向的判定提供参考，为IM的免疫治疗提供依据。