响应面法优化花椒精油微胶囊的制备

张倩，孟凡冰,2*，熊杨洋，李云成,2，刘达玉

(1.成都大学 药学与生物工程学院，成都 610106；2.农业农村部杂粮加工重点实验室，成都 610106)

花椒为芸香科植物的干燥成熟果皮[1]，是常用的食品调味料，因其具有独特的“麻味”而深受人们喜爱，被誉为“八大味”之一[2]。花椒中独特的“麻味”主要由花椒麻素产生，花椒麻素是一类链状不饱和脂肪酸酰胺类物质，具有强烈的刺激性。然而，花椒麻素稳定性较低，在调味品加工和贮藏过程中，光照、高温、高压、pH改变等容易导致其降解或异构转化，引起产品麻味衰减。因此，花椒麻素稳定性保护成为调味品领域关注的焦点。花椒精油是花椒麻素含量最高的一种花椒制品，其在氧气、光照、湿度及温度较高时化学性质不稳定，因此在食品加工中的应用受到限制[3]。采用微胶囊技术包埋花椒精油可使液态的精油转变为易于储藏的固态粉末，避免精油与外界环境的接触，大大提高其对光、热、氧的稳定性，从而延长花椒精油的贮藏期[4-5]。

环糊精分子具有独特的疏水腔和亲水表面结构，可作为乳化包埋剂包埋各种疏水性生物活性[6]。环糊精研究较多且具有重要应用价值的是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，在这些环糊精中，β-环糊精分子量适中，形成的分子空洞孔隙适中，可适用于多种生物活性物质的包埋，并且其价格低廉、实用性高，因而成为最常用的一种[7]。羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)是β-环糊精的醚化衍生物，其具有更高的水溶性、低毒性和令人满意的包埋能力，近年来在食品行业受到广泛关注和应用[8]。

本文以花椒精油为芯材，羟丙基-β-环糊精和大豆分离蛋白为壁材，研究精油浓度、壁芯比、加水量与壁材比和均质时间对花椒精油微胶囊包埋效果的影响，以花椒麻素中的两种麻味物质羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素含量的变化评价包埋效果变化，采用冷冻干燥法制备花椒精油微胶囊，并通过响应面法优化花椒精油微胶囊制备工艺，以期制备出包埋率高、稳定性好的花椒精油微胶囊化产品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒精油：重庆华萃生物技术股份有限公司；羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素标准品、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、阿拉伯胶(Acacia)：上海源叶生物科技有限公司；色谱甲醇、色谱乙腈：Thermo Fisher Scientific公司；大豆分离蛋白：武汉祥迪食品配料有限公司。

1.2 仪器与设备

BDS Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；LC-20AD高效液相色谱仪(配备二元LC-20AB型泵、SPD-20A型检测器和SIL-20AC型自动进样器) 日本岛津公司；FJ200-SH均质机 上海标本模型厂；FD-1A-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山椒素液相检测条件的建立

标准溶液的配制：分别称取0.0010 g羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素标准品，用甲醇定容至100.0 mL，配制成质量浓度为10.0 mg/L的标准溶液，再稀释成0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mg/L的混标溶液[9-10]。

液相条件：BDS Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A乙腈(50)-B纯水(50)；流速：1.0 mL/min；检测波长：268 nm；柱温：35 ℃。

1.3.2 微胶囊壁材的选择

研究β-环糊精(β-CD)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和阿拉伯胶(Acacia)3种壁材分别与2 g大豆分离蛋白复配(SPI)使用，对比3种壁材对1%(精油/纯水，m/m)和5%花椒精油的包埋效果。通过测定其干燥产率和包埋率选择包埋效果最好的一种，加水量与壁材比为6，均质时间为60 s，壁材的选择设计见表1。

表1 不同壁材与不同精油组合使用设计表Table 1 Design table for combination use of different wall materials and different essential oils

1.3.3 花椒精油微胶囊的制备

将壁材按比例混合分散在蒸馏水中以制备乳液，将乳液搅拌均匀后在常温下存放3 h，以确保组分充分水合。随后将花椒精油按照一定比例加入其中，再用均质机在8000 r/min的转速下混合一定时间。将制得的乳液在-20 ℃下冷冻过夜，再在-70～-80 ℃和<9 Pa压力下冷冻干燥48 h，磨成细粉后于-20 ℃保存备用[11]。

1.3.4 影响花椒精油微胶囊制备效果的单因素试验

以1.3.2中选择的最优壁材组合进行后续试验，通过预试验选定单因素：花椒精油的浓度(1%、2%、3%、4%、5%)、壁材与芯材的比例(5，6，7，8，9)、加水量与壁材比(4，8，12，16，20)、均质时间(30，60，90，120，150 s)4个因素，分析各个因素对微胶囊包埋率的影响[12-13]。

1.3.4.1 花椒精油的浓度对包埋效果的影响

称取2.50 g HP-β-CD与2.00 g大豆分离蛋白分散在25 mL蒸馏水中来制备乳液，均质时间设置为60 s，添加的花椒精油的质量分别为0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 g(花椒精油的浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%)，检测不同花椒精油浓度的包理效果。

1.3.4.2 壁芯比对包埋效果的影响

分别称取1.75，2.50，3.25，4.00，4.75 g HP-β-CD，再分别加2.00 g大豆分离蛋白(壁芯比分别为5，6，7，8，9)，将其分散在25 mL蒸馏水中来制备乳液，均质时间设置为60 s，添加的花椒精油的质量为0.75 g，检测不同壁芯比下花椒精油的包埋效果。

1.3.4.3 加水量与壁材比对包埋效果的影响

称取2.50 g HP-β-CD与2.00 g大豆分离蛋白分别分散在18，36，54，72，90 mL蒸馏水中(加水量与壁材比分别为4，8，12，16，20)制备乳液，均质时间设置为60 s，添加的花椒精油的质量为0.75 g，检测不同加水量与壁材比下花椒精油的包埋效果。

1.3.4.4 均质时间对包埋效果的影响

称取2.50 g HP-β-CD与2.00 g大豆分离蛋白分散在25 mL蒸馏水中来制备乳液,均质时间分别设置为30，60，90，120，150 s，添加的花椒精油的质量为0.75 g，检测不同均质时间下花椒精油的包埋效果。

1.3.5 响应面优化花椒精油微胶囊制备工艺条件

确定花椒精油微胶囊的最佳工艺条件，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计，选取花椒精油的浓度(A)、壁芯比(B)、加水量与壁材比(C)、均质时间(D)中对响应值(包埋率)有显著性影响的3个水平，以羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素总包埋率(R)作为输出指标[14-18]。数据使用 Design-Expert 8.0.6 软件进行分析，见表2。

表2 响应面试验因素水平编码表Table 2 The factors and levels of response surface test

1.3.6 花椒精油微胶囊包埋效果分析[19]

1.3.6.1 花椒精油微胶囊干燥产率的测定

通过冷冻干燥花椒精油微胶囊溶液得到的粉末重量计算产率(Y)，该产品干燥产率是产品回收的总质量与冷冻干燥前花椒精油微胶囊溶液的质量之间的比值，根据式(1)计算：

Y(%)=微胶囊粉末质量(g)/乳液总质量(g)。

(1)

1.3.6.2 花椒精油微胶囊包埋率的测定

总油的测定：准确称取0.5 g花椒精油微胶囊粉末，溶于25 mL无水乙醇中，超声均质15 min后取2 mL上清液与18 mL甲醇溶液混合均匀，取2 mL过滤膜，采用HPLC测定总油中羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的含量。

表面油的测定：准确称取0.5 g花椒精油微胶囊粉末，溶于25 mL石油醚溶液中，摇匀后静置15 min，取2 mL上清液与18 mL甲醇溶液混合均匀，取2 mL过滤膜，采用HPLC测定总油中羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的含量。

包埋率(%)=(1-表面油含量/总油含量)×100%。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

按照 1.3.1色谱条件测定各浓度羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素标准品峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，标准品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，结果羟基-α-山椒素在0.4～2 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=8E-06x-0.0606，R2=0.9991，羟基-β-山椒素在0.4～2 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为 y=2E-05x-0.0692，R2=0.9992，并且在该色谱条件下峰形对称、分离效果较好，见图1。

图1 花椒麻素液相图Fig.1 Liquid phase diagram of sanshoamides

2.2 壁材的选择

按照1.3.6花椒精油微胶囊包埋效果分析干燥产率和包埋率的测定方法，对不同壁材和不同浓度的花椒精油组合的10个样品进行测定，测定结果见表3。

表3 不同壁材干燥率及包埋率的对比Table 3 Comparison of drying rates and embedding rates of different wall materials %

干燥产率的测定结果表明，羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)与大豆分离蛋白(SPI)复合包埋花椒精油的干燥产率高于其他壁材的，干燥产率由大到小依次为：HP-β-CD+SPI >β-CD+SPI >Acacia+SPI >HP-β-CD+Acacia+SPI>β-CD+Acacia+SPI，并且5%精油添加量的干燥产率低于1%精油添加量的。由包埋率的测定结果可知，HP-β-CD与SPI复合包埋花椒精油的包埋率均高于其他壁材的，包埋率排序与干燥率排序相同。同样，1%精油添加量的包埋率最高。由干燥产率和包埋率可知，用HP-β-CD与SPI复合使用包埋1%精油的组合效果最好，因此用表1中组合①HP-β-CD+SPI为壁材、1%精油为芯材进行后续的单因素试验。

2.3 单因素试验

以2.2中选择的壁材组合HP-β-CD+SPI为壁材、1%精油为芯材进行单因素试验，考察花椒精油浓度(1%、2%、3%、4%、5%)、壁芯比(5，6，7，8，9)、加水量与壁材比(4，8，12，16，20)、均质时间(30，60，90，120，150 s)4个因素对微胶囊包埋率的影响。

2.3.1 花椒精油的浓度对包埋效果的影响

图2 花椒精油浓度对包埋率的影响Fig.2 Effect of Zanthoxylum essential oil concentration on embedding rate

由图2可知，花椒精油的浓度对微胶囊的包埋率有着较为明显的影响，包埋率随着精油浓度的升高呈现出先升高后下降的趋势，精油浓度在1%～2%时，包埋率呈现上升趋势，而从2%开始包埋率呈现出下降趋势。由此可见，适量的精油添加量才能达到好的包埋效果，精油的添加量过多不仅浪费了材料，而且因壁材所围成的分子空洞孔隙不够容纳所有精油导致包埋率降低，而精油浓度过少会浪费多余的壁材。因此，花椒精油浓度添加量最好在1%～3%的范围内。

2.3.2 壁芯比对包埋效果的影响

图3 壁芯比对包埋率的影响Fig.3 Effect of ratio of wall material to core material on embedding rate

由图3可知，壁芯比对花椒精油微胶囊的包埋率有非常明显的影响，包埋率在壁芯比为7时最高，壁芯比在5～7呈现上升的趋势，在7～9呈现下降的趋势。壁材含量过少，在水中形成的空间较小，容纳精油的含量有限，而壁材含量过多，不仅会造成壁材的浪费，还会因为乳液黏度大而延长干燥时间。因此，壁芯比最好控制在6～8的范围内。

2.3.3 加水量与壁材比对包埋效果的影响

图4 加水量与壁材比对包埋率的影响Fig.4 Effect of ratio of water additive amount to wall material on embedding rate

由图4可知，加水量与壁材比对花椒精油微胶囊的包埋率有一定程度的影响，微胶囊的包埋率随着加水量与壁材比的增加呈现出整体上升的趋势，但加水量与壁材比从16～20的范围内包埋率开始呈现出一定的下降趋势。壁材的两亲性只有在与水发生反应时才能体现，适当的加水量更加利于包埋反应的进行，更有利于形成稳定微胶囊包埋物。因此，加水量与壁材比最好控制在12～20的范围内。

2.3.4 均质时间对包埋效果的影响

图5 均质时间对包埋率的影响Fig.5 Effect of homogenization time on embedding rate

由图5可知，均质时间对花椒精油微胶囊的包埋率有着一定程度的影响，从包埋率的升降趋势可以看出，均质时间在30～60 s之间，包埋率呈现轻微的上升趋势，在60～150 s之间包埋率逐渐开始下降。均质机是通过高速剪切力将芯材与壁材充分混合形成水包油的乳液，均质时间过短会导致混合剪切不充分、乳液不稳定，从而降低包埋率，均质时间过长不仅没有提高微胶囊的包埋率，还浪费了均质的成本。因此，均质时间最好选择在30～90 s的范围内。

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面试验设计及结果

在2.3单因素试验基础上，分别选取4个单因素中对花椒精油微胶囊包埋率有显著影响的3个水平进行响应面试验，花椒精油浓度(A)为1%、2%、3%，壁芯比(B)为6，7，8，加水量与壁材比(C)为12，16，20，均质时间(D)为30，60，90 s。29个试验组合点以及对应的试验结果见表4，29个试验点包括24个析因点和5个零点。响应面优化以包埋率(R)为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件对结果进行分析，结果见表5。

表4 Box-Behnken试验方案及结果Table 4 Box-Behnken test scheme and results

2.4.2 包埋率回归模型建立及方差分析

利用Design-Expert 8.0.6软件对表4进行二次多项回归拟合试验和方差分析，反映花椒精油浓度、壁芯比、加水量和壁材比以及均质时间对包埋效率的影响，得到表5回归方程方差分析表，利用软件进行拟合得多元二次回归方程：Y=96.61-1.11A-0.86B-0.15C-0.78D-1.50AB+0.46AC+0.99AD+1.48BC-0.13BD-1.06CD-4.06A2-6.09B2-2.37C2-1.35D2。

表5 包埋率回归方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of embedding rate regression equation

表6 模型数据分析Table 6 The data analysis of model

由表5回归分析结果可知，一次项 A、B、D与二次项A2、B2、C2及交互项AB、BC对花椒精油微胶囊包埋率的影响极其显著。A、B、C、D 4个因素对包埋效率的影响排序为A>B>D>C，即花椒精油浓度>壁芯比>均质时间>加水量与壁材比。方差分析结果显示该模型的P<0.0001，表明回归模型极显著。失拟项=0.1163>0.05，不显著，说明该试验误差小，回归模型方程与试验结果拟合度好，并且由表6可知该模型的复相关系数平方R2=0.9728，响应变量RAdj2=0.9456，模型的变异系数为0.93%，说明试验具有很高的可信性和准确性，可以用于花椒精油微胶囊化包埋效率的理论预测。

2.4.3 响应面交互作用分析

根据回归方程对花椒精油浓度、壁芯比、加水量与壁材比以及均质时间两两组合的交互作用进行分析，分别得到各因素交互作用关系的响应面图和等高线图，见图6～图11。

图6 花椒精油浓度和壁芯比对包埋率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface diagrams and contour plots of the influence of Zanthoxylum essential oil concentration and ratio of wall material to core material on the embedding rate

由图6可知，花椒精油浓度和壁芯比的交互作用，当花椒精油的浓度为1%～3%中任意一值时，微胶囊的包埋率随着壁芯比的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度明显。当壁芯比为6～8中任意一值时，微胶囊的包埋率随着花椒精油浓度的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度明显。等高线图呈现椭圆形，说明花椒精油浓度和壁芯比的交互作用显著。

图7 花椒精油浓度和加水量与壁材比对包埋率影响的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface diagrams and contour plots of the influence of Zanthoxylum essential oil concentration and ratio of water additive amount to wall material on the embedding rate

由图7可知，花椒精油浓度和加水量与壁材比的交互作用，当花椒精油的浓度为1%～3%中任意一值时，微胶囊的包埋率随着加水量与壁材比的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较小。当加水量与壁材比为12～20中任意一值时，微胶囊的包埋率随着花椒精油浓度的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较小。等高线图接近圆形，说明花椒精油浓度和加水量与壁材比的交互作用不显著。

图8 花椒精油浓度和均质时间对包埋率影响的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface diagrams and contour plots of the influence of Zanthoxylum essential oil concentration and homogenization time on the embedding rate

由图8可知，花椒精油浓度和均质时间的交互作用，当花椒精油的浓度为1%～3%中任意一值时，微胶囊的包埋率随着均质时间的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较小。当均质时间为30～90 s中任意一值时，微胶囊的包埋率随着花椒精油浓度的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较小。等高线图呈现椭圆形，说明花椒精油浓度和均质时间的交互作用显著。

图9 壁芯比和加水量与壁材比对包埋率影响的响应面图和等高线图Fig.9 Response surface diagrams and contour plots of the influence of ratio of wall material to core material and ratio of water additive amount to wall material on the embedding rate

由图9可知，壁芯比和加水量与壁材比的交互作用，当壁芯比为6～8中任意一值时，微胶囊的包埋率随着加水量与壁材比的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较明显。当加水量与壁材比为12～20中任意一值时，微胶囊的包埋率随着壁芯比的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度明显。等高线图呈现椭圆形，说明壁芯比和加水量与壁材比的交互作用显著。

图10 壁芯比和均质时间对包埋率影响的响应面图和等高线图Fig.10 Response surface diagrams and contour plots of the influence of ratio of wall material to core material and homogenization time on the embedding rate

由图10可知，壁芯比和均质时间的交互作用，当壁芯比为6～8中任意一值时，微胶囊的包埋率随着均质时间的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较小。当均质时间为30～90 s中任意一值时，微胶囊的包埋率随着壁芯比的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较明显。等高线图呈现椭圆形，说明壁芯比和均质时间的交互作用显著。

图11 加水量与壁材比和均质时间对包埋率影响的响应面图和等高线图Fig.11 Response surface diagrams and contour plots of the influence of ratio of water additive amount to wall material and homogenization time on the embedding rate

由图11可知，加水量与壁材比和均质时间的交互作用，当加水量与壁材比为12～20中任意一值时，微胶囊的包埋率随着均质时间的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较小。当均质时间为30～90 s中任意一值时，微胶囊的包埋率随着加水量与壁材比的增加呈现出先增大后减小的趋势，变化幅度较小。等高线图呈现椭圆形，说明加水量与壁材比和均质时间的交互作用显著。

2.4.4 最优工艺的验证试验

在选取的各因素范围内，通过Design-Expert 8.0.6软件分析得到最佳包埋工艺条件，即花椒精油浓度为1.83%，壁芯比为6.96，加水量与壁材比为16.07，均质时间为49.34 s，微胶囊的包埋率为96.86%。考虑到实际操作的问题，将最佳工艺条件修改为：花椒精油浓度为1.8%，壁芯比为7，加水量与壁材比为16，均质时间为50 s。采用此工艺条件进行验证试验，重复3次，测得微胶囊包埋率为(96.35±0.94)%，与理论预测值较为接近，说明该回归方程与实际情况拟合程度好，响应面得到的最佳工艺参数可靠，同时也说明运用响应面法优化微胶囊的制备工艺是可行的。

3 结论

选择羟丙基-β-环糊精与大豆分离蛋白的复配物为微胶囊壁材，采用冷冻干燥法制备花椒精油微胶囊。通过单因素试验初步选取各因素水平范围，在此基础上进行响应面试验，以花椒精油微胶囊包埋率为响应值，以精油浓度、壁芯比、加水量与壁材比和均质时间4个因素为响应因子建立二次回归实际方程模型。结果显示：制备花椒精油微胶囊的最佳工艺条件为：花椒精油浓度为1.8%，壁芯比为7，加水量与壁材比为16，均质时间为50 s，按此最佳工艺条件制备的花椒精油微胶囊包埋率为(96.35±0.94)%。目前国内采用改性壁材包埋花椒精油的研究较少，本试验为花椒精油微胶囊壁材的选择提供了一定的数据参考，同时，为花椒精油的保藏奠定了一定的理论基础。