窖蛋白-1在衰老中的作用和信号通路

侯丽雅李欣悦白琳

(国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021)

衰老是一个复杂的多因素过程,其特征是退化过程的积累,涉及分子途径内的多种变化和破坏,衰老产生机制包括DNA损伤、活性氧(ROS)累积、分泌表型的变化等,这些过程不仅发生在细胞和分子水平,也发生在组织和器官系统[1]。衰老的本质是一种细胞反应,表现为细胞周期停滞、炎性介质的分泌以及其他表型改变[1-2]。衰老细胞随着年龄的增长在组织中逐渐积累,并导致衰老和相关的疾病发展,例如癌症、II型糖尿病及动脉粥样硬化等[3]。

胞膜窖作为细胞膜的重要成分,对于衰老信号的应激、转导都有重要的作用。研究表明窖蛋白-1在调节衰老的过程中发挥重要作用[4]。目前已有众多研究表明窖蛋白-1在不同组织器官、不同细胞系中影响衰老并调节相关信号通路,然而其对调节衰老的作用和信号通路各不相同。因此,本文概述了窖蛋白-1的结构和功能,从细胞、组织、器官和整体水平综述了窖蛋白-1在衰老中的作用和调节机制,可能为治疗衰老及相关疾病提供潜在的靶点。

1 窖蛋白-1的结构及功能

胞膜窖(caveolae)又称小窝,是存在于许多哺乳动物细胞膜表面上的瓶颈状内陷,具有特殊的脂筏结构,含有丰富的胆固醇、鞘磷脂以及许多跨膜蛋白,与细胞信号转导、脂质调节以及内吞作用等许多功能有关[5]。目前已鉴定出3种哺乳动物的窖蛋白,分别是窖蛋白-1、窖蛋白-2及窖蛋白-3,它们在不同的组织细胞中表达[6]。其中对窖蛋白-1的结构和功能研究最为广泛,众多研究表明其在衰老中发挥重要作用[7]。

窖蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是胞膜窖的标志性支架蛋白,分子量为22×103,在许多细胞类型中表达,包括脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等[8]。Cav-1在细胞膜上形成发夹结构,其蛋白序列包含四个结构域:(1)NH2末端结构域;(2)能够识别胆固醇并与之相互作用的共有序列(CRAC),以及泛素化位点的支架结构域(CSD;第82-101位残基);(3)与膜脂质相互作用的膜结构域;(4)具有三个棕榈酰化位点的COOH-末端结构域[4]。其N端和C端两个末端结构域都保留在细胞质中,支架结构域(CSD)序列可结合许多不同的信号分子并影响细胞信号转导,例如与Src家族蛋白、表皮生长因子(EGF)受体、异源三聚体G蛋白,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、蛋白激酶A、蛋白激酶C等相互作用[9]。除此以外,Cav-1在维持胞膜窖的形成和稳定性、胞吐和胞吞、平衡胆固醇、脂质代谢、线粒体功能、增殖、迁移和衰老等方面也具有重要作用[4,9]。

2 Cav-1在衰老中的作用

Cav-1在调控衰老的过程中发挥重要作用。对Cav-1在动物方面的研究包括在小鼠、大鼠、线虫、蠕虫等多种动物上。动物研究表明,老年大鼠的脑、脾、肺[10]、老年小鼠骨骼肌[11]中均显示出Cav-1的大量增加,表明Cav-1与衰老相关。Head等[12]还发现Cav-1敲除(KO)的年轻小鼠表现出神经元过早衰老和退化的迹象。Razani等[13]观察到Cav-1 KO小鼠在进入老年后体重显著降低,这表明缺乏Cav-1的小鼠可能在神经发育、脂质代谢或脂肪细胞功能方面存在问题;小鼠缺乏Cav-1与多种表型有关,如肺和心脏缺陷、血管异常、动脉粥样硬化、代谢障碍和癌症[14-15]。与此结果相反的是,Cav-1表达减少会延长秀丽隐杆线虫的寿命[16]。用Cav-1 RNAi细菌处理无菌的CF512蠕虫,发现Cav-1的敲除导致寿命延长[16],这种相反的结论还没有找到科学的解释。

在细胞水平,Cav-1在不同细胞系、衰老细胞以及过表达、敲除、敲降细胞系等方面均有研究。Hayflick等[17]观察到人类二倍体成纤维细胞在有限数量的细胞分裂后永久停止分裂,在细胞周期的G1期变得不可逆性停滞。因此对细胞衰老的定义为体细胞不可逆的细胞周期停滞(大多数肿瘤细胞和某些干细胞除外),并能分泌过多的炎症介质和生长因子,从而改变衰老细胞的微环境[4]。Park等[10]发现衰老的人二倍体成纤维细胞中Cav-1表达上调,并与EGFR共定位。虽然衰老细胞中的Cav-1水平较高,但通过降低Cav-1的水平可以逆转衰老表型,在衰老细胞中敲除Cav-1可导致细胞呈年轻状态的形态变化,导致它们变小和呈纺锤形[18]。Yu等[19]针对不同细胞系中Cav-1的表达进行了研究,在A549人肺癌细胞、H460人肺癌细胞中、HCT116人结直肠癌细胞以及人二倍体成纤维细胞(HDFs)中敲降Cav-1后,发现这些细胞系均表现衰老,其细胞增殖能力和集落形成能力均显著降低。Cav-1敲降不仅阻止了G1期的细胞周期,还显著升高了另外两个G1期阻滞标记p53和p21的表达。Yang等[20]同样表明Cav-1敲降会诱导人大肠癌细胞的衰老样形态变化,并阻止其在体外和体内的细胞生长。此外,早有研究表明Cav-1的过表达在小鼠成纤维细胞的原代培养物中会诱导细胞早衰[21]。因此,Cav-1的过度表达和强烈抑制都会导致细胞过早衰老,而正常的细胞功能可通过Cav-1表达的正常化来恢复。严重的Cav-1缺乏在某些细胞类型中会导致早衰,这种效应与线粒体功能障碍有关[19]。Cav-1的过度表达抑制了包括血管平滑肌细胞在内的各种细胞的生长,这是进入衰老终末状态的前奏[20,22]。

在人的大脑皮层中[23]、前列腺平滑肌以及上皮[24]中发现Cav-1的表达随着年龄的增长而升高。Kruglikov等[25]发现Cav-1的表达随着皮肤的老化逐渐上升,并且伴随着皮肤中透明质酸含量下降以及胶原蛋白表达的减少。Powter等[26]发现Cav-1还参与血管的衰老表型和炎症反应。这些结果表明,Cav-1在老年人的多种器官、组织中表达上调,表明其在衰老中的关键调控作用。阿尔茨海默病是衰老相关疾病,阿尔茨海默病患者海马的Cav-1蛋白水平和额叶皮质Cav-1基因水平增加[27]。此外,在Cav-1对早衰的研究中,Xin等[28]发现Cav-1通过p53途径介导高糖诱导的人肾小球系膜细胞衰老,阻断Cav-1能够显著降低细胞衰老,为治疗肾功能衰竭提供了新的靶点。

3 Cav-1衰老相关通路

细胞衰老可能由多种因素引起,氧化应激是造成细胞衰老的一个主要原因。氧化应激造成的DNA损伤导致细胞周期停滞,加速衰老的开始,即为早衰。氧化应激与衰老理论表明,衰老细胞的积累导致衰老相关的功能丧失。氧化应激诱导衰老的确切机制仍不清楚,但可能通过增加活性氧(ROS)的水平导致细胞衰老,可以阻止细胞增殖以响应复制过程中发生的损坏[29]。衰老细胞获得不可逆的衰老相关分泌表型,例如导致衰老的p53/p21途径的调节、NF-κB活性增加、叉头蛋白O(FoxO)蛋白活性的抑制、胰岛素/胰岛素样生长因子1(IGF1)介导的对氧化应激的保护、分泌大量炎性因子等[30]。

3.1 Cav-1与p53/p21途径

p53/p21通路的激活是Cav-1促进衰老的关键信号。在小鼠胚胎成纤维细胞中,Cav-1缺乏通过p53/p21途径诱导细胞衰老[19];在髓核细胞中,Cav-1同样通过体外p53/p21信号通路调节氧化应激诱导的细胞衰老[30]。

Cav-1过表达诱导早衰并激活p53途径,Cav-1通过支架结构域直接与信号中间体结合,从而激活p53肿瘤抑制蛋白,p53负调控子Mdm2具有Cav-1结合基序,并被Cav-1隔离胞膜窖中,限制其与p53的相互作用,从而稳定p53并使得下游蛋白p21表达上调,导致细胞周期停滞和早衰[31]。因此,Cav-1表达通过p53/p21Waf1/Cip1依赖机制诱导G0/G1期阻滞而负调节细胞周期进程[32]。

共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)是应激诱导的p53和p53信号通路的关键调节因子[33]。Cav-1在氧化应激后通过将蛋白磷酸酶2A(PP2A)的催化亚单元——ATM隔绝到胞膜窖中来激活ATM,ATM磷酸化并激活p53。PP2A属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的保守磷酸蛋白磷酸酶家族,调节多种细胞过程[34]。PP2A是由催化性C亚基(PP2A-C)、支架A亚基(PP2A-A)和调节性B亚基(PP2A-B)组成的全酶。Volonte等[35]的研究表明,吸烟可导致Cav-1的表达增加,进而激活ATM,激活p53,上调p21Waf1/Cip1,从而诱导肺成纤维细胞的细胞衰老,发展成肺气肿,较为清晰地阐明了Cav-1/p53/p21诱导衰老的途径(图1a)。

此外,研究表明聚合酶I和转录释放因子(PTRF)通过Cav-1/p53/p21途径诱导造血干细胞衰老[36]。PTRF可作为胞膜窖的外壳蛋白。PTRF通过p53/p21和Cav-1途径调节细胞衰老(图1a),PTRF过表达诱导了细胞衰老,PTRF表达减少则延长了细胞的复制寿命,Cav-1似乎受PTRF磷酸化的调节[37],然而其内在确切机制仍需要进一步探究。

Cav-1激活p53/p21途径并诱导早衰,这是由于其能够直接与Mdm2、PP2A-C、Sirt1等相互作用,并在氧化应激后将其隔离到胞膜窖中[4]。Mdm2是p53的负调节因子,促进p53降解。Mdm2在胞膜窖中的隔离导致Mdm2活性的抑制,p53表达的稳定和早衰[31]。PP2A是体内自动磷酸化和活性的负调节因子。氧化应激后,Cav-1介导的PP2A-C在胞膜窖中的定位抑制了PP2A,促进p53的ATM依赖性磷酸化/活化,从而诱导细胞衰老[35]。Sirt1是一种Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,调节多种细胞过程,包括细胞衰老。氧化应激促进Sirt1与Cav-1相互作用,使Sirt1失活,进而导致p53乙酰化/活化和诱导早衰[38]。因此,p53/p21途径被激活导致细胞衰老[39]。

p53/p21途径的激活还可以通过多种机制发生。除上述之外还有很多,例如致癌相关蛋白K-Ras、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、博莱霉素、高糖、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、胰岛素/IGF-1途径通过Cav-1介导的信号转导诱导衰老(图1b)。最近的研究还表明胰岛素/IGF-1信号调节窖蛋白可调节秀丽隐杆线虫的衰老[40]。最后,由Cav-1激活的黏附斑激酶(FAK)和GTPases促进衰老细胞典型的形态学改变。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)上调Cav-1的表达,并促进NADPH氧化酶亚单位p47phox向巨噬细胞胞膜窖的移位/激活,导致ROS依赖性衰老表型的发展[41]。

3.2 Cav-1与生长因子受体

Cav-1与生长因子受体(如表皮生长因子和胰岛素受体)以及其他信号分子(如蛋白激酶A、Src激酶等)相互作用,导致这些蛋白质的活性大多受到负调节[20,40]。胰岛素/PI3K(磷酸肌醇3-激酶)/PKB(蛋白激酶B)(又称Akt)途径是调节多种细胞功能和过程的主要信号途径[42]。FoxO转录因子是线虫转录因子DAF-16(衰变加速因子16)的人类同源物,含有翼螺旋结构域的蛋白质,受胰岛素/PI3K/PKB信号级联的直接控制。研究表明FoxO通过与Cav-1启动子区域的直接结合介导Cav-1对生长因子信号的内源性调节,并且这种调节方式与细胞周期无关[43]。蛋白激酶B(PKB)磷酸化使得FoxO家族转录因子失活。当激活时,FoxO因子可与Cav-1启动子序列中的DNA结合,随后调节基因表达;在基因和蛋白质水平上过度表达FoxO因子,Cav-1的表达增加;激活的Cav-1介导表皮生长因子(EGF)诱导的信号减弱,FoxO对Cav-1的上调部分导致EGF诱导的MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)磷酸化,从而使得MAPK活性明显下调(图1c)。然而,这种衰老表型可以通过降低Cav-1的表达水平来逆转[43-44],这表明这种衰老状态是可逆的表型。

此外,Cav-1的过表达可能通过抑制EGF诱导的EGFR介导的Raf/MAP激酶ERK激酶(MEK)/ERK(Raf-MEK-ERK)通路的信号转导[20](图1c)。Cav-1表达的下调激活体内MEK和ERK的信号,可能是通过提前释放激活的ERK-1/2和p42/44 MAP激酶的其他成分级联到胞质溶胶中[20]。Cav-1过表达抑制EGF的表达,从而抑制下游EGFR介导的Raf-MEK-ERK信号通路[14,20]。

3.3 Cav-1与其他信号分子

Cav-1参与衰老和细胞周期停滞的基因转录中存在许多细胞类型依赖性控制,其调控机制较为复杂。最近有文献表明衰老相关基因PAI-1调控Cav-1介导的衰老相关信号通路(TGF-β1/Src激酶/p53)的分子机制,进一步阐明Cav-1相关的衰老通路[22]。除此之外,氧化应激可通过p38/MAPK/Sp1介导的两个富含GC的启动子元件的激活来刺激Cav-1基因转录,从而诱导早衰(图1d),该途径在表达Cav-1的正常上皮细胞中有活性,但在不表达Cav-1并在氧化应激后发生凋亡的MCF-7乳腺癌细胞中没有活性,因此Cav-1可能作为控制氧化应激的乳腺癌细胞中衰老和凋亡细胞程序的转换者[45]。

衰老细胞通常会伴随着不可逆的衰老相关分泌表型,例如炎症因子的释放。NF-κB是一种驱动衰老的重要转录因子,在对炎症、遗传毒性和氧化应激的反应中被激活。高浓度ROS促进NF-κB的激活,而NF-κB可以通过上调Cav-1的表达介导衰老的信号通路[46](图1d)。

图1 Cav-1介导细胞衰老的相关通路Figure 1 Cav-1 related pathways that mediate cell senescence

4 讨论

综上,Cav-1在调控衰老的过程中发挥重要作用。对Cav-1在动物水平研究中,大部分研究表明在老年动物中Cav-1表达上调,Cav1过表达会诱导早衰,Cav-1缺乏将导致衰老相关的多种疾病,然而也有部分研究结果与之相反,主要集中在线虫,Cav-1表达减少会延长线虫的寿命,推测这可能是由于不同物种间基因表达差异导致的相反结论。在人类的多种器官及组织中,Cav-1表达上调,并伴随着年龄相关疾病的发展,提示Cav-1的研究对于延缓衰老、治疗衰老相关疾病发挥潜在作用。研究表明Cav-1是细胞衰老的主要调节因子[4]。其过表达或抑制均会产生衰老的相关表型。关于Cav-1在细胞衰老过程中的作用,同样会出现一些自相矛盾的观察,例如,尽管线粒体功能障碍会导致衰老,然而Cav-1缺乏能够防止活性氧诱导的细胞衰老[19]。这种悖论出现已久,可能是Cav-1在不同细胞类型或者不同应激或衰老诱导剂中发挥的作用不同所导致,Yu等[19]的研究与此推测一致,虽然Cav-1的减少和增加都与早衰有关,大部分研究表明这与氧化应激诱导有关,但Cav-1缺乏是通过一种活性氧非依赖性途径诱导细胞衰老,Cav-1缺乏通过激活p53-p21途径诱导细胞衰老,并损害线粒体呼吸,导致SIRT1失活。

Cav-1介导的细胞衰老通路较为复杂,目前仅现冰山一角。本文主要介绍了Cav-1调控衰老的几条关键通路,如p53/p21途径、胰岛素/PI3K/PKB/FoxO途径、p38MAPK途径、NF-κB途径等。Cav-1介导的细胞衰老通路仍没有确切的全部机制,有一些通路之间的关联及分子机制尚不明确,因此,对于Cav-1介导的细胞衰老相关通路仍需要进一步探究。