8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌炎症及运动能力的影响

罗勇黄金玲

(1.南京信息职业技术学院,南京 210023;2.南京工业大学浦江学院,南京 211134)

诸多研究证实高脂膳食诱导的肥胖与机体慢性炎症的出现息息相关[1],同时机体慢性炎症也是肥胖诱发胰岛素抵抗的重要因素[2-3],与2型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝等多种慢性代谢性疾病的发生发展关系密切[4-5]。

众所周知,运动干预是防治肥胖等多种慢性代谢性疾病的有效手段,而探索运动改善慢性代谢性疾病的途径对于更好的理解其在防治慢性代谢性疾病中的作用具有重要意义[6-7]。因此,本文对高脂膳食诱导的肥胖小鼠进行为期8周的有氧运动干预,检测有氧运动对肥胖小鼠运动能力、骨骼肌骨架蛋白分布、肌萎缩相关蛋白表达、骨骼肌炎症细胞浸润以及炎症因子蛋白表达的影响,并提出假设:高脂膳食相关肥胖诱发骨骼肌慢性炎症反应,导致骨骼肌萎缩和运动能力下降,而有氧运动可能通过降低骨骼肌中慢性炎症水平,改善肥胖诱导的骨骼肌萎缩,进而发挥提高运动能力并改善肥胖的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

46只SPF级5周龄C57BL/6健康雄性小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0006】,体重约为(17.54±1.46)g,饲养于SPF级动物实验室【SYXK(京)2016-0033】。大鼠自由饮水进食,温度22～24℃,相对湿度40%～60%,12 h昼/12 h夜循环照明,饲喂普通维持饲料和高脂膳食均由北京华阜康生物科技有限公司【SCXK(京)2020-0004】提供。所有实验方案均获得运动科学伦理委员会批准(IACUC 2019025A)。

1.1.2 主要试剂与仪器

Desmin、Atrogin-1、MuRF1、TNF-α、IL-1β和IL-10抗体均购自美国Abcam公司,β-tubulin抗体购自北京中衫金桥公司,苏木精-伊红染色试剂购自北京碧云天生物公司。

实验动物气体代谢监测系统购自美国Columbus公司,酶标仪、垂直电泳仪及凝胶成像仪均购自美国BIO-RAD公司,病理切片机、激光共聚焦显微镜均购自德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型制备

小鼠平均体重为(17.54±1.46)g,适应性喂养1周后,将小鼠随机分为对照组(16只,正常饲料,3.85 kcal/g,脂肪供能比为12%)和高脂膳食组(30只,高脂饲料,5.24 kcal/g,脂肪供能比为60%),喂养12周制备肥胖小鼠模型。以空腹条件下高脂膳食组体重超过对照组平均体重20%作为判断肥胖小鼠模型建模成功的标准[8],本研究通过12周高脂膳食制备肥胖模型小鼠20只,用于后续干预研究。

1.2.2 运动干预及实验分组

采用实验动物气体代谢监测系统进行小鼠最大运动能力测试,计算最大运动强度作为设定运动干预强度的参考。最大运动能力测试后,对照组和肥胖组均组内随机分为对照安静组(CS组,8只)、对照运动组(CE组,8只)、肥胖安静组(OS组,10只)和肥胖运动组(OE组,10只)。CS组和OS组维持原有饲养条件,CE组和OE组维持原有膳食不变,进行最大运动强度60%的中等强度跑台有氧运动,坡度0°,每周6 d,每天1 h,持续8周。干预结束后再次对各组小鼠进行最大运动能力测试。

1.2.3 实验样本采集与制备

末次运动48 h后对小鼠进行称重取材,取材前禁食12 h。腹腔注射3%戊巴比妥钠(3 mL/kg)麻醉小鼠后取双侧后肢背侧腓肠肌,用手术刀剔除肌腱等结缔组织,一侧标本经PBS漂洗,滤纸吸干水分后迅速置于液氮中用于提取蛋白进行后续检测;另一侧标本置于包埋剂中包埋,用于后续制作冰冻切片进行免疫化学染色和HE染色。

1.2.4 免疫荧光染色检测小鼠骨骼肌骨架蛋白分布

制备小鼠骨骼肌组织冰冻切片,PBS清洗后以组化笔在组织周围画圈。5%羊血清室温封闭30 min,一抗Desmin(1∶500)在湿盒内4℃孵育过夜,次日清洗后以一抗相同种属的荧光二抗避光孵育2 h(1∶500),清洗后DAPI孵育10 min并以抗荧光淬灭封片剂封片。处理完毕后激光共聚焦显微镜观察并采集图像,以Image Pro Plus 6.0软件处理图像。

1.2.5 HE染色检测小鼠骨骼肌横截面积和炎症细胞浸润

制备小鼠骨骼肌组织冰冻切片,切片入苏木素染液浸染5 min,自来水洗后切片入乙醇脱水,然后入伊红染液中染色。之后切片依次放入无水乙醇和二甲苯逐步脱水,最后中性树胶封片后以显微镜镜检并采集图像进行分析。图像中细胞质呈红色,细胞核呈蓝色。

1.2.6 Western Blot检测小鼠骨骼肌萎缩和炎症相关蛋白表达

称取小鼠骨骼肌组织约200 mg,加入RIPA试剂匀浆,4℃离心后以BCA方法进行蛋白定量,电泳时上样量为每孔30μg。一抗Atrogin-1(1∶2000)、MuRF1(1∶1000)、TNF-α(1∶2000)、IL-1β(1∶3000)、IL-10(1∶3000)和β-tubulin(1∶5000)4℃孵育过夜。次日洗膜并加入一抗相同种属的二抗(1∶3000)孵育2 h。充分洗二抗后使用试剂盒进行化学发光,于凝胶成像仪中显像。β-tubulin为内参,Image Pro Plus 6.0软件处理图像。

1.3 统计学分析

实验数据均以平均值±标准差(±s)表示,采用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析。采用Levene检验进行方差齐性检验,双因素方差分析(Two-way ANOVA)方法处理数据。P＜0.05为差异具有显著性。Graphpad prism 7绘制图表。

2 结果

2.1 8周有氧运动对肥胖小鼠体重的影响

图1显示,8周运动干预期间OS组和OE组能量摄入均分别显著高于CS组和CE组(P＜0.01),且CE组和OE组能量摄入均分别与CS组和OS组无显著差异(P＞0.05)。通过检测小鼠体重,发现有氧运动干预前OS组和OE组体重均分别显著高于CS组和CE组(P＜0.01),干预期间OS组体重均显著高于CS组(P＜0.01);尽管OE组体重同样显著高于CE组(P＜0.05),但有氧运动干预至第3周,OE组体重即显著低于OS组(P＜0.05),至第5周以后差异非常显著(P＜0.01)。另外,有氧运动干预第6周起,CE组小鼠体重显著低于CS组(P＜0.05)。

图1 8周有氧运动下肥胖小鼠能量摄入和体重变化Note.CS.Control-sedentary group.CE.Control-exercise group.OS.Obesity-sedentary group.OE.Obesity-exercise group.Compared with matched control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared with matched sedentary group,#P＜0.05,##P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Changes of food intake and body weight in obese mice during 8-week aerobic exercise

2.2 8周有氧运动对肥胖小鼠运动能力的影响

图2显示,OS组小鼠的运动时长、跑动距离和峰值跑速均显著低于CS组(P＜0.01)。尽管有氧运动干预8周后,OE组小鼠的运动时长、跑动距离和峰值跑速同样显著低于CE组(P＜0.01),但相较于OS组,以上指标均显著提高(P＜0.05)。另外,有氧运动干预期间CE组与CS组小鼠运动至力竭的运动时长、跑动距离和峰值跑速未见明显差异(P＞0.05)。

图2 8周有氧运动对肥胖小鼠运动至力竭的运动时长、运动距离和峰值跑速的影响Note.Time,distance and peak speed exercising to exhaustion were detected by a graded exercise testing with animal metabolism detection system.Figure 2 Effects of 8-week aerobic exercise on the time,distance and peak speed in obese mice exercising to exhaustion

2.3 8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌骨架蛋白和肌萎缩相关蛋白表达的影响

图3显示,CS组和CE组小鼠骨骼肌中Desmin蛋白排列整齐且分布均匀,而高脂膳食干预的OS组小鼠骨骼肌中Desmin蛋白排列紊乱、模糊甚至缺失,提示OS组小鼠骨骼肌存在一定程度损伤。有氧运动干预8周后,OE组小鼠骨骼肌中Desmin蛋白相比OS组更趋于整齐排列并均匀分布。

图3 8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌Desmin蛋白分布的影响Note.Distribution of Desmin protein was detected by Immunofluorescent staining.Figure 3 Effect of 8-week aerobic exercise on the distribution of Desmin protein in skeletal muscle of obese mice

图4显示,OS组小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表达均显著高于CS组(P＜0.01)。有氧运动干预8周后,OE组小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表达则均显著低于OS组(P＜0.01)。另外,CE组小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表达同样显著低于CS组(P＜0.01)。

2.4 8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌炎症细胞浸润的影响

图5显示,OS组小鼠骨骼肌纤维横截面积显著低于CS组(P＜0.01),而有氧运动干预8周后OE组小鼠骨骼肌纤维横截面积则均显著高于OS组(P＜0.01),这一结果与图4中骨骼肌萎缩相关蛋白表达结果一致。通过观察小鼠骨骼肌切片中炎症细胞浸润情况,发现OS组小鼠骨骼肌出现萎缩同时炎症细胞浸润明显增加(黑色箭头标识),而有氧运动干预8周后OE组小鼠骨骼肌中炎症细胞浸润明显减少,提示骨骼肌炎症可能参与有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌萎缩的改善作用。

图4 8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌Atrogin-1和MuRF1蛋白表达的影响Note.Expression of Atrogin-1 and MuRF1 were detected by Western Blot.Figure 4 Effect of 8-week aerobic exercise on the expression of Atrogin-1 and MuRF1 protein in skeletal muscle of obese mice

图5 8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌纤维横截面积和炎症浸润的影响Note.Slides of skeletal muscle tissue were performed with HE staining.Figure 5 Effects of 8-week aerobic exercise on skeletal muscle fiber cross-sectional area and inflammatory infiltration in obese mice

2.5 8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌炎症因子蛋白表达的影响

图6显示,相较于CS组,OS组小鼠骨骼肌中TNFα蛋白表达显著增加(P＜0.01),IL-10蛋白表达显著下降(P＜0.05)。有氧运动干预8周后,相较于OS组,OE组小鼠骨骼肌中TNF-α和IL-1β蛋白表达显著下降(P＜0.05),IL-10蛋白表达则显著增加(P＜0.01)。另外,CE组小鼠骨骼肌中TNF-α和IL-1β蛋白表达均显著下降(P＜0.01),IL-10蛋白表达则显著增加(P＜0.05)。

图6 8周有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌TNF-α,IL-1βand IL-10蛋白表达的影响Note.Expression of TNF-α,IL-1βand IL-10 were detected by Western Blot.Figure 6 Effect of 8 weeks aerobic exercise on the expression of TNF-α,IL-1βand IL-10 protein in skeletal muscle of obese mice

3 讨论

肥胖是一种严重危害人类健康的慢性疾病,而肥胖相关的慢性炎症是胰岛素抵抗等慢性代谢性疾病发生发展的关键因素,已成为近年来人们关注和研究的重点[9-10]。众所周知,有氧运动干预是防治慢性代谢性疾病的有效手段,已被纳入治病处方中[11];而运动对于慢性代谢性疾病的防治作用是全身性的整合过程,探索运动改善慢性代谢性疾病的途径对于更好的理解其在防治慢性代谢性疾病中的作用具有重要意义[12]。本研究通过12周高脂膳食干预制备肥胖小鼠模型,然后以最大运动强度60%的中等强度有氧运动干预8周,检测运动干预后小鼠体重、运动能力、骨骼肌骨架蛋白分布、肌萎缩相关蛋白表达、骨骼肌炎症细胞浸润以及炎症因子蛋白表达的变化,旨在一方面为理解有氧运动改善肥胖的作用提供重要新证据,另一方面有助于进一步阐明运动改善肥胖等慢性代谢性疾病的可能途径及慢性炎症的调节作用。

肥胖患者普遍存在运动能力降低,这不仅影响其日常生活活动,更造成其生命质量低下和社会功能下降[13]。本研究中12周高脂膳食诱导的肥胖小鼠运动至力竭的运动时长、跑动距离和峰值跑速均明显低于正常小鼠,这与大部分相关研究结果一致[7,9]。在不改变小鼠膳食构成前提下,8周有氧运动干预有效降低肥胖小鼠体重的同时使得肥胖小鼠运动能力得到明显提高,说明有氧运动是独立于饮食方式的改善肥胖等慢性代谢性疾病的有效手段[14-15]。

运动能力受多种因素制约,其中骨骼肌质量是影响运动能力的关键因素[16]。同时,肥胖期间内脏脂肪组织的肥大导致肌肉功能障碍,抑制肌管中收缩蛋白表达,进而导致骨骼肌萎缩[17-18]。因此,本研究接下来以骨骼肌萎缩为切入点,研究有氧运动改善肥胖并提高运动能力的可能途径。Atrogin-1和MuRF1是在骨骼肌中表达的E3泛素连接酶,是骨骼肌萎缩发生的标志蛋白[19]。王继等[20]研究发现,高脂膳食诱导的糖尿病小鼠骨骼肌中MuRF1和Atrogin-1表达均显著降低,而4周运动干预可有效降低骨骼肌中MuRF1和Atrogin-1表达。本研究同样发现肥胖小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表达明显增加且骨骼肌纤维横截面积明显下降,说明肥胖小鼠体内存在骨骼肌萎缩现象。8周有氧运动干预后,肥胖小鼠Atrogin-1和MuRF1蛋白表达明显减少且骨骼肌纤维横截面面积明显增加。Desmin是骨骼肌肌节外骨架蛋白,连接相邻肌原纤维Z线和肌纤维膜,是维持骨骼肌Z线稳定的重要蛋白[21]。本研究还发现高脂膳食诱导的肥胖小鼠骨骼肌中Desmin排列紊乱、模糊甚至缺失,8周离心运动干预后肥胖小鼠骨骼肌中Desmin蛋白排列明显趋于整齐并均匀分布。以上提示有氧运动干预可能通过抑制骨骼肌萎缩、促进修复来发挥提高肥胖小鼠运动能力并降低体重的作用。

炎症是机体固有的保护性免疫机制,但慢性炎症导致骨骼肌萎缩,被认为是糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病等常见疾病的发病基础[22]。同时,诸多研究证实高脂膳食诱导的肥胖与机体慢性炎症的出现息息相关[23-24]。本研究接下来从骨骼肌炎症角度探索有氧运动改善骨骼肌损伤并抑制骨骼肌萎缩,进而提高运动能力、降低体重的可能途径。研究表明,TNF-α和IL-1β是典型的促炎性细胞因子,参与机体慢性炎症的发生与发展[25];IL-10是典型的抗炎性细胞因子,抑制机体炎症反应并促进组织修复[26]。本研究中高脂膳食诱导的肥胖小鼠骨骼肌中出现明显的炎症浸润,同时促炎因子TNF-α表达明显增加、抗炎因子IL-10表达明显减少,说明肥胖小鼠骨骼肌中存在慢性炎症现象。8周有氧运动干预后,肥胖小鼠骨骼肌中炎症浸润现象明显减轻,促炎因子TNF-α和IL-1β表达明显减少、抗炎因子IL-10表达明显增加,提示有氧运动干预可能通过降低骨骼肌中慢性炎症反应来改善肥胖诱导的骨骼肌萎缩和运动能力下降,继而发挥改善肥胖等慢性代谢性疾病的作用。

综上所述,本研究从运动能力、骨骼肌骨架蛋白分布、骨骼肌纤维横截面积及其萎缩标志蛋白表达、骨骼肌炎症细胞浸润及其炎症因子蛋白表达4个方面证实高脂膳食相关肥胖诱发骨骼肌慢性炎症反应,导致骨骼肌萎缩和运动能力下降;而有氧运动有效改善肥胖诱导的骨骼肌萎缩,进而发挥提高运动能力并改善肥胖的作用,骨骼肌组织中炎症调节可能是其中的重要原因之一。