顺铂连续和间隔造模诱发的药源性虚证小鼠类固醇激素合成能力的比较研究

农淄心邓琳张超峰贺健祥谢海纳潘志强*

(1.上海中医药大学基础医学院,上海 201203;2.上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203)

顺铂(Cisplatin,CDDP)是临床常用的抗肿瘤药物,针对女性常见恶性肿瘤诸如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌,顺铂是常选的化疗药物之一。由于卵巢对化疗极为敏感,常导致卵巢早衰,可能与顺铂促使原始卵泡死亡、减少原始卵泡储备、导致卵泡闭锁、降低雌二醇等有关,因此,基础研究常将顺铂作为动物卵巢早衰模型的药物[1]。卵巢是女性重要的类固醇激素合成组织,受下丘脑、垂体高级中枢的调控,同时与肾上腺皮质轴存在相互影响。而发育和生殖的功能在中医学属“肾藏精”的功能,肾精不足的虚证常与生殖系统损伤相联系。在顺铂治疗过程中,类固醇激素合成相关的的下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)和下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)受顺铂影响是否与虚证发生有关[2-4]。对此,本文采用雌性小鼠为对象,同步比较顺铂短时间连续给药与长时程间断给药的方案,发现两种造模方式均可以导致小鼠药源性虚证,对性腺轴的损害较严重,而肾上腺皮质轴呈现较强的代偿性,短期连续给药对下丘脑、垂体功能的损害更明显。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40只SPF级4～5周龄ICR雌性小鼠,体重20～25 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCSK(沪)2017-0005】。动物饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级饲养室【SYXK(沪)2020-0009】,室温22～25°C,湿度50%～60%,12 h明暗交替,自由饮水,予以普通饲料喂养。本实验方案符合上海中医药大学实验动物伦理委员会要求(PZSHUTCM200904017)。

1.1.2 主要试剂与仪器

注射用顺铂(冻干型)(齐鲁制药有限公司);RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔/小鼠IgG(H+L)、封闭液、一抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司);RNAiso Plus、PrimeScript® RT reagent Kit、SYBR®Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)II(宝生物工程(大连)有限公司);A5441抗体β-actin抗体(Sigma-Aldrich,美国);ab96637-StAR 抗体、ab175408-Cyp11A1抗体、ab232701-Cyp21A2抗体、ab2298821-Cyp11B1抗体(Abcam,美国)。CP225D型电子天平(赛多利斯,德国),7500 Fast型实时荧光定量PCR仪(ABI,美国),Elx800型酶标仪(Biotek,美国),alpha化学发光型凝胶成像系统(Protein-Simple,美国),YLS-4C型转棒式疲劳仪、YLS-13A小鼠抓力测试仪(山东省医学科学院设备站),Tissuelyser-64L多样品组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与药物干预

小鼠适应性饲养1周后开始实验,随机分为连续对照组、连续造模组、间隔对照组和间隔造模组,每组10只。连续造模组将顺铂用生理盐水稀释到0.3 mg/mL,按照3 mg/kg顺铂腹腔注射,每天1次,连续7 d[5]。间隔造模组将顺铂用生理盐水稀释至浓度为1 mg/mL,按照10 mg/kg顺铂腹腔注射,每周1次,共4次(D1、D7、D14、D21)[6]。对照组注射等量生理盐水。

1.2.2 小鼠体重检测

每日上午8:30记录连续造模组小鼠体重,每周2次记录间隔造模组小鼠体重。

1.2.3 小鼠气虚疲乏指标检测

(1)旷场实验:将小鼠分别置于铺设有4 cm×4 cm方块的透明塑料板的旷场笼中,录像并统计小鼠1 min内水平和垂直运动的次数。其后肢移动的格子数记为水平运动,前肢离地的次数记为垂直运动,以分析小鼠自主活动度。

(2)抓力测试:同一人使用小鼠抓力仪进行测试,每只小鼠记录3次,取平均值分析小鼠气力。

(3)转棒疲劳试验:设定转速为30 r/min,每次实验前将每只小鼠在机器上进行3次适应训练。最大转棒时间设置为10 min,超过记为10 min,以分析小鼠疲劳度。

(4)小鼠脏器:处死小鼠前记录小鼠体重,称取小鼠脾、心脏、双侧肾和胸腺质量。

1.2.4 小鼠肾上腺与卵巢组织切片及HE染色

将肾上腺与卵巢组织用10%甲醛溶液固定后,常规石蜡包埋与切片;HE染色,将切片浸泡于苏木素溶液中染色,取出冲洗后放入伊红染液复染并冲洗;进行脱水,透明,封片,晾干。并置于10×10、10×20和10×40显微镜下,观察分析肾上腺和卵巢的组织结构和细胞形态并采集图像[7]。

1.2.5 RT-qPCR检测相关基因表达

取小鼠肾上腺、卵巢、下丘脑和垂体组织,分别加入TRIzol试剂抽提总RNA。采用Primer3(v.0.4.0)在线软件设计引物并委托Life Technologies公司合成(见表1)。应用PrimeScript RT试剂盒进行逆转录反应制备cDNA,反应体系为40μL,反应条件为37℃15 min,85℃5 s,4℃终止;PCR扩增反应体系为20μL,反应程序为95°C变性3 min,95°C退火30 s,60℃延伸30 s,40个循环。每组3个复孔,采用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primers

1.2.6 Western Blot检测相关蛋白表达

取小鼠肾上腺、卵巢分别置于含有0.5 mL或1 mL RIPA裂解液的EP管中,研磨后,4°C条件下14 000 r/min离心15 min,取上清液。BCA法测定总蛋白浓度。各孔取20μg蛋白上样,于10%SDSPAGE凝胶进蛋白分离(浓缩胶电压80 V,30 min;分离胶电压120 V,90 min)。将分离后的蛋白电转移(恒流250 mA,150 min),加入封闭液封闭1.5 h。加入TBST溶液,置于摇床上振荡洗膜,清洗3次,每次10 min,分别加入一抗抗体(β-actin抗体的体积稀释比例为1∶50 000,其他抗体的体积稀释比例均为1∶2000),4℃孵育过夜。次日洗膜(同上),加入HRP标记的山羊抗兔/小鼠IgG(体积稀释比例为1∶2000),室温孵育1.5 h。洗膜后依据说明书滴加显色剂进行显影,采用Image J图像分析管理系统对蛋白条带灰度值进行分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析和作图。采用非配对t检验或Mann-Whitney test分析。P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 顺铂对小鼠体质量的影响

与对照组比较,顺铂连续腹腔注射造模后,小鼠体重下降(P＜0.01);顺铂间隔造模组小鼠体重增长速度显著低于对照组(P＜0.05)(见图1)。提示不同频次顺铂造模均可抑制小鼠体重增长。

图1 顺铂对小鼠体重的影响Note.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Influence of mice body weight by the cisplatin

2.2 顺铂对小鼠气虚疲乏指标的影响

与对照组比较,顺铂连续造模或间隔造模对小鼠转棒运动与小鼠四肢抓力均无明显影响;然而,顺铂连续造模后小鼠水平移动跨格子数明显下降(P＜0.01),顺铂间隔造模组第20天后小鼠水平移动跨格子数及垂直运动的自主活动度均显著降低(P＜0.05)(见图2)。由于疲劳转棒运动与四肢抓力反映了小鼠被动行为,旷场活动度反映了小鼠自主行为,综合这三项指标,提示连续造模或间隔造模致顺铂累积后可以诱导小鼠气虚证特征。

图2 顺铂对小鼠气虚疲乏指标的影响Figure 2 Influence of mice index of deficiency of vital energy and fatigue by the cisplatin

2.3 顺铂对小鼠脏器的影响

与对照组比较,顺铂连续造模后显著抑制小鼠心脏与胸腺(P＜0.01);顺铂间隔造模后小鼠脾、双肾和胸腺质量下降(P＜0.05)(见图3)。提示顺铂累积效应对小鼠免疫器官影响更显著。

图3 顺铂对小鼠脏器的影响Figure 3 Influence of mice visceral organ weight influence by the cisplatin

2.4 顺铂对小鼠类固醇激素合成组织形态的影响

2.4.1 顺铂对小鼠肾上腺皮质形态的影响

与对照组比较,顺铂连续造模和间隔造模后均无明显改变(见图4),提示顺铂对雌性小鼠肾上腺损伤不明显。

2.4.2 顺铂对小鼠卵巢形态的影响

与对照组比较,顺铂连续造模和间隔造模后均出现小鼠卵巢大量原始卵泡被激活,分化出大量初级和次级卵泡,闭锁卵泡增多,原始卵泡和成熟卵泡减少,卵泡膜变薄,卵泡膜细胞减少,卵泡颗粒细胞减少,黄体和白体增多,卵泡膜细胞分布紊乱。其中顺铂连续造模后出现大量闭锁卵泡,卵泡膜变薄明显;顺铂间隔造模后则出现更多的黄体和白体,卵泡上的膜细胞和颗粒细胞分布紊乱明显(见图4)。提示顺铂能加速激活原始卵泡分化,产生大量闭锁卵泡,诱导膜细胞及颗粒细胞凋亡,健康的成熟卵泡减少。

图4 顺铂对小鼠肾上腺皮质与卵巢形态的改变Note.■.Adrenal cortex.×.Adrenal medulla.★.Globular zone.♦.Fascicular zone.▼.Reticular zone.○.Follicular cavity.□.Corpus luteum.▲.Atresic follicle.●.Corpus albicans.←.Primordial follicle.→.Primary follicle.↑.Secondary follicle.↓.Mature follicle.↘.Theca follicularis.↖.Granulosa cells.Figure 4 Histological changes of adrenal and ovary by the cisplatin of the mice

2.5 顺铂对小鼠肾上腺皮质类固醇激素合成酶的影响

与对照组比较,顺铂连续造模后C yp21a1明显下降(P＜0.05),但顺铂对雌性小鼠肾上腺Star、C yp11a1与Cyp11b1的mRNA表达无明显影响(见图5)。StAR蛋白表达量在顺铂连续造模后明显下降(P＜0.05),在顺铂间隔造模后明显上升(P＜0.05),但顺铂间隔造模后抑制CYP11B1的蛋白表达,雌性小鼠肾上腺CYP11A1和CYP21A2蛋白表达变化不明显(见图6)。

图5 顺铂对小鼠肾上腺皮质类固醇激素合成酶的影响Figure 5 Influence of the steroid hormone synthetase mRNA expression in adrenal cortex by the cisplatin of the mice

提示顺铂短期连续造模会抑制肾上腺StAR蛋白表达,对雌性小鼠肾上腺类固醇合成酶的表达以抑制效应为主。长期间隔给药则导致StAR代偿性升高,与肾上腺皮质激素应激过程有关,而长期间隔造模可能会抑制肾上腺皮质酮合成能力,但总体上对雌性小鼠肾上腺类固醇合成酶影响较小,可能与肾上腺皮质参与应激的自我代偿性反应有关。

2.6 顺铂对小鼠卵巢雌二醇合成的影响

2.6.1 顺铂对小鼠卵巢类固醇合成酶的影响

与对照组比较,顺铂连续造模后,小鼠卵巢C yp11a1的mRNA表达量明显上调(P＜0.05),C yp17a1表达明显下调,而Hsd3b2明显上调(P＜0.01);而间隔造模后小鼠小鼠卵巢StAR蛋白表达量明显下调(P＜0.01),Hsd3b2的mRNA表达量明显下调(P＜0.01)(见图6)。由于P450c17酶催化17α羟基孕烯醇酮合成DHEA,而DHEA是雄激素合成的前体物质;3βHSD2酶是催化雄烯二酮和睾酮合成酶,结果Cyp17a1和Hsd3b2表达相反模式,提示顺铂对卵巢雄激素的合成存在替代途径。

图6 顺铂对小鼠肾上腺和卵巢类固醇激素合成酶蛋白表达的影响Figure 6 Influence of the steroid hormone synthetase protein expression in adrenal cortex and ovary by the cisplatin of the mice

与对照组比较,顺铂连续造模后,小鼠卵巢Cyp19a1和Hsd17b1的mRNA表达量无明显影响(见图7)。由于Cyp19a1和Hsd17b1是合成雌二醇2条途径的重要酶,结果Cyp19a1和Hsd17b1表达相反模式,提示顺铂对卵巢雌二醇的合成也存在替代途径。

图7 顺铂对小鼠卵巢类固醇激素合成酶mRNA表达的影响Figure 7 Influence of the steroid hormone synthetase mRNA expression in ovary by the cisplatin of the mice

2.6.2 顺铂对小鼠卵巢雌激素受体Esr1(ERα)、Esr2(ERβ)和Gper1的影响

与对照组比较,顺铂连续造模后,小鼠卵巢Esr1和G per1的mRNA表达量明显上调(P＜0.01),见图8,提示顺铂连续造模后,小鼠卵巢内雌激素受体表达增强。

图8 顺铂对小鼠卵巢雌激素受体的影响Esr1、Esr2和Gper1Figure 8 Influence of the estrogen receptor Esr1、Esr2 and Gper1 by the cisplatin

综上,短期顺铂连续造模后,小鼠卵巢类固醇激素合成酶可能受应激部分上调,雌激素受体表达也增强,但间隔造模后类固醇激素合成酶以表达下调为主。雄激素的合成会受C yp17a1和Hsd3b2的下调而明显减少,虽然顺铂对雌激素合成必要的C yp19a1和Hsd17b1无明显影响,对雄激素向雌激素的转化功能可能影响较小,但雄激素作为雌激素的前体,其产量减少也可能影响雌激素的总量。

2.7 顺铂对小鼠下丘脑的影响

与对照组比较,顺铂连续造模后下丘脑GnRH和CRH的表达明显下调(P＜0.05);而间隔造模组无明显差异,见图9,提示短期顺铂连续造模抑制下丘脑功能,促性腺激素释放素(GnRH)和促肾上腺素释放激素(CRH)水平下降。

图9 顺铂对小鼠下丘脑的影响Figure 9 Influence of the hypothalamus by the cisplatin

2.8 顺铂对小鼠垂体的影响

与对照组比较,顺铂连续造模垂体Pomc、Fshb、Pou1f1表达明显升高(P＜0.01);而间隔造模组Lhb表达显著下降(P＜0.01),见图10,提示短期顺铂连续造模抑制下丘脑功能后导致垂体功能代偿性升高;而长期间断给药对垂体功能影响较弱。

图10 顺铂对小鼠垂体的影响Figure 10 Influence of the pituitary by the cisplatin of the mice

3 讨论

顺铂抗肿瘤药效是确切的,但是其毒性作用限制了其药效的最大化,寻找降低顺铂毒性作用又能确保其药理作用的用药方案是临床与基础研究不断探索的课题。由于顺铂存在生殖毒性[8]以及卵巢对顺铂的敏感性,顺铂连续给药造模的卵巢早衰模型[9]已被学术界广泛采用。但临床治疗中,短期的连续给药会使顺铂大量沉积,产生较多强烈的毒副作用[10],而长期的间隔给药可能更为贴近临床上顺铂的实际使用情况,间隔期间有助于机体细胞对顺铂毒性的修复,能减少其他器官受顺铂沉积的影响。此外卵巢早衰在中医治疗上多以补益气血、温肾填精为主,肾虚是主要病因之一[11]。因此,本研究主要从肾虚相关的HPA轴和HPG轴改变[3-4],采用顺铂短期连续给药与长期间断给药的方案,比较评价两种造模对雌性小鼠卵巢、肾上腺类固醇激素合成能力的影响。

采用顺铂短时间连续给药与长时程间断给药的方案,比较2种造模对雌性小鼠卵巢、肾上腺类固醇激素合成的影响,结果发现,顺铂连续造模和间隔造模完成后小鼠的体重、自主活动度均明显下降,顺铂连续造模显著抑制小鼠心脏与胸腺,顺铂间隔造模小鼠脾、双肾和胸腺质量均下降。提示顺铂即使间隔给药,因药物在体内的累计效应,仍然对小鼠自主活动能力及体重与脏器有明显的抑制作用,呈现类似中医气虚证、精气不足的特征。进一步从类固醇激素合成组织的形态学变化看,发现顺铂连续造模和间隔造模后,两组小鼠卵巢均可见大量的闭锁卵泡形成,健康的成熟卵泡减少,卵泡膜细胞和颗粒细胞明显减少,两种造模后卵巢损伤均很明显。而肾上腺皮质球状带、束状带与网状带细胞未见明显的变化,可能与雌激素对于HPA轴的增益作用[12]以及肾上腺皮质参与体内应激过程的代偿性自我保护有关。因此,同为类固醇激素合成的组织,卵巢更容易受到顺铂的损伤。

在此基础上,检测顺铂对类固醇激素合成与储备功能的影响。由于肾上腺皮质激素与卵巢雌激素合成的起始过程相同,均以胆固醇为原料,通过细胞内类固醇急性调节蛋白(StAR)与胆固醇侧链裂解酶(P450scc,由CYP11A1基因编码)合成孕烯醇酮作为重要的前体物质。结果发现,StAR蛋白在肾上腺组织连续造模后明显下降、间隔造模后明显上升,推测顺铂短时间大量沉积后对肾上腺皮质线粒体上与胆固醇转运相关的StAR受氧化应激损伤有关[1,13],而间隔造模受这种氧化应激的损伤相对较弱。而卵巢StAR蛋白表达在间隔造模后显著下降,提示顺铂累积性损伤卵巢雌激素合成过程。而线粒体内Cyp11a1作为类固醇激素合成的限速酶,肾上腺组织Cyp11a1基因与蛋白表达均未出现明显的变化,顺铂连续造模后,小鼠卵巢Cyp11a1基因表达明显上调,但是其蛋白表达也无明显变化。在LH峰出现,卵泡膜细胞和颗粒细胞黄体化的过程中,StAR、P450scc和3β-HSD的酶活性及表达量会随着黄体的发育以及卵巢孕酮合成量的增加,在顺铂诱发小鼠卵巢早衰的过程中,黄体化也会影响这些酶的表达[14]。出现卵巢和肾上腺同种类固醇合成酶表达趋势的不同。

进一步检测肾上腺皮质激素合成的重要酶,发现仅在连续给药后抑制肾上腺Cyp21a1基因表达,对Cyp11b1表达无明显的影响。提示顺铂连续给药可能抑制孕烯醇酮向皮质激素转化过程,但是最终不影响皮质酮的合成,提示肾上腺具有较强的自我代偿性保护生理作用。然而,顺铂对卵巢的作用不同,发现卵巢雄激素合成过程的重要酶Cyp17a1与Hsd3b2基因表达显著被顺铂抑制。由于卵巢的雄激素主要在卵泡膜细胞合成分泌,而雌激素的芳香化酶主要存在于颗粒细胞,雄激素在膜细胞形成后在颗粒细胞催化成雌激素,顺铂造模后卵巢形态学上的改变是卵巢早衰的主要原因。卵巢膜细胞是卵巢内雄激素合成的主要场所[1],本研究中卵巢膜细胞的改变明显,卵巢膜变薄、膜细胞数量减少可能是雄激素合成酶表达量降低的原因之一。此外,雄激素合成的关键步骤,即主要存在于内质网的细胞色素P450c17a(CYP17A1)编码的17α-羟化酶将孕烯醇酮催化为孕酮或17α-羟基孕烯醇酮,再由CYP17A1同步编码的17,20-裂解酶转化为脱氢表雄酮或雄烯二酮,其中HSD3B2在催化生成雄烯二酮的过程中也发挥了作用[15-16]。顺铂造成的内质网应激可能是连续造模后Cyp17a1表达下调和间隔造模后Hsd3b2表达下调的主要原因[15]。本研究中卵巢的形态学改变明显,卵泡的颗粒细胞明显减少,但卵巢的雌激素合成需要的芳香化酶和羟类固醇脱氢酶并没有明显改变,考虑与卵巢内卵泡活化过度,致黄体的形成增多有关。

针对类固醇激素分泌调节的上级中枢功能,检测发现顺铂连续造模后下丘脑促性腺激素释放素(GnRH)和促肾上腺素释放激素(CRH)的表达明显下调,垂体Pomc、Fshb、Pou1f1表达明显升高;而间隔造模垂体Lhb表达显著下降。提示顺铂连续造模抑制下丘脑功能后导致垂体功能代偿性升高;而长期间断给药对垂体功能影响较弱。雌二醇下调和FSH的升高是卵巢早衰的两大指标,但间隔造模组垂体促性腺激素Fshb和Lhb的表达未见上调,因此顺铂间隔造模可能并不能形成典型的卵巢早衰模型。而连续造模后HPG轴的顶端激素GnRH抑制明显,而垂体促性腺激素的mRNA水平上调显著,呈现出典型的卵巢早衰特点。

有研究表明,性腺类固醇激素能影响HPA轴应激。与雄性相比,雌性能表现出更强的HPA轴反馈,血液雌二醇升高能能通过雌激素受体调节CRH神经元影响上调应激相关激素的水平[17],LH通过作用于卵泡膜细胞和颗粒细胞来控制类固醇生成。LH作用于皮层细胞以增加参与雄激素,雄烯二酮生产的酶的合成。雄烯二酮从卵泡膜细胞中释放出来,并被邻近的颗粒细胞吸收,通过芳香酶的作用转化为雌酮,再通过HSD17B1的作用转化为雌二醇。Lhb的mRNA表达未见升高甚至在间隔造模组下调,可能是卵巢类固醇激素合成酶,尤其是催化雄激素转化为雌激素的两种酶未见下调的另一个原因。

下丘脑及边缘系统的雌激素受体对HPA活性可能具有相反的影响,即ERβ(Esr2)抑制,而ERα(Esr1)促进HPA轴[14]。此外,雌激素受体在卵巢对于卵泡和各细胞分化有重要的调节作用,雌二醇能通过ERα和GPER1刺激卵巢的细胞增殖[18],本研究发现顺铂连续造模后卵巢内的Esr1表达显著升高,Gper1表达的同步升高,与卵巢内卵泡的过度活化和和雌激素对于HPA轴的增益有关。提示顺铂对类固醇激素合成组织卵巢的选择性更强。

综上所述,本研究发现,顺铂能够诱发小鼠气虚、精气不足相关证候表现;顺铂对于类固醇激素合成组织的卵巢选择性损伤大于肾上腺,顺铂对卵巢雄激素与雌激素合成存在替代途径的活跃方式,短期连续给药也进一步抑制HPA轴和HPG轴的高级中枢下丘脑和垂体功能。