慢性髓性白血病患者BCR-ABL融合基因的规范化检测及临床应用

秦亚溱

(北京大学人民医院，北京大学血液病研究所，国家血液系统疾病临床医学研究中心，北京 100044)

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性肿瘤，染色体易位t(9;22)(q34;q11)形成的BCR-ABL融合基因是其特征性分子标志[1-2]。本世纪以来，靶向BCR-ABL的伊马替尼等酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的应用给CML治疗带来革命性变化，绝大部分患者的生存期已与常人相同，并可能实现功能性治愈[3-4]。BCR-ABL定量及突变检测是CML患者诊断及长期治疗过程中疗效监测的基本手段，而检测规范化是其发挥临床指导作用的前提, 也是CML患者获得最佳疗效的保证。在此，将对CML患者BCR-ABL的规范化检测及临床应用展开探讨。

1 CML患者BCR-ABL融合基因类型

Ph染色体是人类发现的第一个与特异恶性疾病----CML相关的染色体异常，随后确认是由染色体易位t(9;22)(q34;q11)所致[1]。在分子水平上，该异位导致22号染色体上的BCR与9号染色体上的ABL形成BCR-ABL融合基因[2]，从而使得ABL酪氨酸激酶处于持续活化状态，这是CML发生的核心机制[5]。

在DNA水平上，BCR基因断裂的区域主要分布于3处[6]：①内含子1，又称为次要断裂点簇集区(m-bcr)；②外显子12～16，又称为主要断裂点簇集区(M-bcr)；③内含子19，又称为μ-bcr；ABL基因的断裂区域跨越外显子1b上游、外显子1b和1a及外显子1a下游。BCR-ABL融合基因转录翻译后分别形成以下3种mRNA和蛋白：e1a2(P190)、e13a2/e14a2(均为P210)和e19a2(P230)；④还有少见的融合类型，如e6a2、e13a3/e14a3等。为了保持读码框以正确翻译ABL蛋白，BCR和ABL之间可能插入部分内含子等序列或者BCR断裂发生在外显子上，如e8-int1b-a2等[7]。

90%～95%的CML患者初诊时可检测到Ph染色体。所有的CML患者均具有BCR-ABL融合基因，我们及国际报道均显示约98% CML患者的BCR-ABL为P210型，其余2%为P230、P190或其它少见类型[7]。

2 BCR-ABL检测方法

由于P210型BCR-ABL在mRNA水平表现均一，因此可以将mRNA逆转录为cDNA后再通过聚合酶链反应(PCR)扩增来确认BCR-ABL融合基因的存在。与传统PCR技术相比，实时定量PCR技术是在反应体系中除了上下游引物之外加入了荧光探针或染料，通过实时检测扩增反应中每一个循环的产物的荧光信号，实现真正准确的定量起始模板。实时定量PCR检测P210型BCR-ABLmRNA具有特异、敏感、快速以及准确定量的特点，是当前临床常规的检测方法[8-9]。进行实时定量PCR时，分别检测BCR-ABL和内参基因(如ABL)定量各自拷贝数，BCR-ABLmRNA水平表示公式如下。

(BCR-ABLcopies/ABL copies)×100%

对于P190和P230型BCR-ABL亦可分别采用各自特异的实时定量PCR检测方法。对于各种少见BCR-ABL类型，可通过多重定性或定量方法结合Sanger测序确定其存在以及融合类型[7]。

目前ABL突变检测的标准方法是PCR结合Sanger测序法[8-9]，首先进行巢式PCR，即先扩增BCR-ABL，然后扩增BCR-ABL上的ABL酪氨酸激酶区(包含第240～500个氨基酸)，再通过Sanger测序来明确BCR-ABL是否发生突变以及突变类型。

3 CML患者BCR-ABL检测的临床应用

BCR-ABL定量及突变检测对于CML患者诊断及监测具有重要意义。

3.1诊断 CML确诊主要依据形态学、细胞遗传学和分子学3个方面。对于绝大多数CML患者，Ph染色体及BCR-ABL融合基因这两项检测结果一致。由于P210型BCR-ABL是CML患者的普遍类型，通过实时定量PCR检测到该mRNA并结合血液形态学表现即可快速确诊。对于P210型BCR-ABL阳性但Ph染色体未检测到的情况，往往是由于异位隐匿或复杂异位掩盖所致，仍可以诊断为CML。当检测到Ph染色体而P210型BCR-ABL未检测到时，提示存在其他的BCR-ABL类型，需通过多重PCR方法进行全面的BCR-ABL类型筛查，并通过荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技术确认BCR-ABL融合基因的存在。2020年欧洲白血病网(ELN)关于CML治疗的推荐提出，CML患者初诊时需确定BCR-ABL融合基因类型，以便后续监测分子学反应采用合适的检测体系[10]。

3.2指导治疗 TKI是当前CML治疗的一线药物。由于大部分CML患者可以通过TKI治疗很快获得完全细胞遗传学缓解(CCyR)，更低水平的肿瘤负荷需要采用更加敏感的分子学检测技术。采用实时定量PCR技术检测BCR-ABLmRNA水平可以准确反映白血病负荷，可用于CML患者分子学反应评估。ELN推荐、美国国立综合癌症网络(NCCN)指南及中国CML指南中对CML患者TKI疗效评估，均采用里程碑的方式[10-12]，即依据治疗后特定的时间点是否获得特定的细胞遗传学(Ph染色体阳性率)及分子学反应(BCR-ABLmRNA水平)，评估患者是否获得最佳疗效，并提示是否需要换用二代或三代TKI。2020年版ELN推荐进一步简化为仅根据特定时间点的BCR-ABLmRNA水平评估TKI疗效，见表1[10]。

表1 欧洲白血病网(ELN)推荐：慢性髓性白血病治疗(2020年版)[10]

研究显示，CML患者获得深层次的分子学反应(一般认为≥MR4.5，即BCR-ABLmRNA水平较初诊下降≥4.5 logs)之后有可能停用TKI并保持主要分子学反应(major molecular response, MMR)，指BCR-ABLmRNA水平较初诊下降3 logs即实现功能性治愈[13]。停药既能提高患者生存质量又可以降低国家医疗保险负担，因而是当前CML治疗追求的目标。BCR-ABLmRNA水平既是停药也是停药后重新服药的基本指征，在停药前后均需要定期密切监测。

TKI治疗过程中可能发生耐药，ABL酪氨酸激酶区发生突变是耐药的重要原因[14]。依据指南评估，当正确服药的CML患者未获得最佳疗效时需要进行ABL激酶区突变检测[10-12]。由于二代TKIs和三代TKIs对不同的突变类型敏感性不同，因此突变表现可指导后续TKIs的选择[10-12]。

4 CML患者BCR-ABL定量检测国际标准化

与其他的血液学诊断技术相比，PCR具有实验步骤和影响因素较多的特点。检测结果准确、稳定是BCR-ABL监测真正发挥临床指导作用的前提。为做到这一点，必须采用标准化的实验方案，执行严格的室内质量控制措施，这样才能让患者在同一家实验室检测的结果具有可比性，正确评估分子学反应，指导临床治疗。

由于试剂、仪器以及内参基因的不同等影响，既使检测准确、稳定，不同实验室检测同一份样本得出的BCR-ABLmRNA水平很可能不同，因此不同实验室的结果不具有可比性。为解决这个问题，国际CML专家于2005年共同提出BCR-ABL定量检测国际标准(international scale, IS)的概念[15]，即通过转换系数(conversion factor, CF)，将各实验室BCR-ABL检测值均转换为国际标准值(BCR-ABLIS)，根据BCR-ABLIS可直接判断CML患者分子学反应，常用的分子学反应指标及定义。见表2。

表2 慢性髓性白血病常用分子学反应指标及定义

因此，通过采用国际标准化的BCR-ABL可以正确评估CML患者分子学反应，从而有效发挥临床治疗指导作用。目前BCR-ABLIS仅适用于具有P210型BCR-ABL的CML患者，其他类型的BCR-ABL尚未引入国际标准化的概念，分子学反应可采用与初诊相比BCR-ABL下降log的评估方式。

5 用于转换BCR-ABLIS的CF获得

执行BCR-ABL国际标准化的核心是CF，有效CF的获得可通过与参比实验室交换样品或与商业化标准物比对来实现。其中前者应用更为广泛。与参比实验室比较过程，通常包括两批派发样本检测比对[16-17]，第一批比对是为了计算CF，第二批为了验证CF，即评估计算出的CF是否可以准确转换第二批样本BCR-ABL。只有验证结果合格，才能说明BCR-ABL检测准确并稳定，该CF可用于CML患者转换BCR-ABL。澳大利亚医学和兽医科学研究所(IMVS)国际参比实验室报道[16]，与IMVS进行样本交换38家实验室中有19家进行了验证，其中11家合格获得有效的CF，利用有效CF转换BCR-ABLIS之后使得实验室间MMR一致率明显提高。欧洲亦开展了基于样本比对的CF获得的工作[17]，他们形成多级网络，即首先由位于德国曼海姆的国际参比实验室验证26个国家级参比实验室获得有效CF，再由这些实验室验证本国的其他实验室。

6 国内BCR-ABL定量检测规范化进展

为了实现BCR-ABL规范化检测并紧跟国际进展，北京大学人民医院北京大学血液病研究所于2010年牵头启动了国内白血病分子检测领域首个多中心规范化项目—“中国CML患者定量PCR检测合作项目”。 2012年，北京大学血液病研究所通过与澳大利亚IMVS国际参比实验室比对获得有效CF。随后，北京大学血液病研究所做为国内唯一的参比实验室，每年通过两批样本派发比对帮助其他实验室获得有效CF[18]。到目前为止，全国实验室参与本项目80余家，其中73家已获得CF实现临床报告BCR-ABLIS。此外，CF获得后并非一劳永逸，只有在检测稳定的前提下才一直可用。就此，北京大学血液病研究所每年还通过派发一批次比对样本来进行已获得CF实验室的再验证[19]，如果合格说明检测稳定CF继续使用，如果不合格则提示检测过程出现问题，实验室需要检查操作规程，针对新的检测状态需要重新计算CF。因此，“中国CML患者定量PCR检测合作项目”促进了国内CML分子学反应评估与国际接轨，并发挥了BCR-ABL检测规范化的外部质控的作用。

7 ABL突变的规范化检测

ABL突变的检测同样需要规范化，具体内容可参见已发表的实验室规范中国专家共识[20]。在此特别强调的是，为保证结果真实可靠，测序图谱的判读一定认真谨慎；只有背景干净的测序图谱才能用于判断ABL突变；对于小突变峰如果不好判断需重新扩增测序。

新一代测序(next generation sequencing, NGS)技术正逐步进入恶性血液病临床应用，由于其高敏感性及可定量的优点，2020年ELN推荐指出可采用NGS检测ABL突变[10]。不过目前在国内，尚待数据支持和专门的规范检测指南的出现。

8 采用外周血标本规范监测CML患者BCR-ABL

规范化的BCR-ABL检测还体现在样本类型上。尽管骨髓是白血病患者实验室检测的基本样本类型，但是外周血与骨髓相比具有患者痛苦小、取材方便等优点。CML患者初诊时，外周血往往具有与骨髓相似的髓系各阶段细胞组成，提示CML患者有可能采用外周血检测。Brandford等[21]报道，外周血定量检测BCR-ABL能够可靠反映CML疗效。随后的有关TKIs治疗CML的各个国际临床实验均是采用外周血检测BCR-ABL。江倩等[22]采用国际上最大宗的样本量，通过外周血与骨髓的配对研究显示，CML患者接受伊马替尼治疗后外周血与骨髓的BCR-ABLmRNA水平总体上具有很高的一致性，并且外周血比骨髓的敏感性更高。由于基于临床实验制定的CML治疗指南及推荐中疗效评估标准均是基于外周血的数据[10-12]，而有些患者外周血和骨髓结果之间存在一定差异。因此，在执行指南评估CML患者TKIs疗效时应该持续采用规范化的样本----外周血检测BCR-ABL。

9 结语及展望

基于TKIs的成功研制及广泛应用，当前CML的诊断、治疗及监测已建成完整而清晰的规范化体系，因此目前存在的主要问题在于执行。一方面是临床层面，除了规范服药外还需规范监测，CML患者应坚持每3个月做1次外周血BCR-ABL定量检测，在BCR-ABL提示升高时以及停药后等特殊阶段还需要增加检测次数，当未达最佳疗效时需检测ABL突变，以便指导临床治疗。另一方面是实验室层面，需严格执行标准操作规程以保证BCR-ABL定量和突变检测结果准确而稳定，并通过参加样本比对或与标准品比对的方式获得CF，以报告BCR-ABLIS，发挥正确的指导临床治疗作用。

分子学检测在恶性血液病诊断监测中发挥着越来越重要的作用，规范化检测是发挥临床指导作用的基石。CML患者BCR-ABL的规范化检测为其它分子学指标提供了很好的范例。