骨水泥与骨形态发生蛋白对骨生长的影响

侯青青，杨 越，徐景超

（河南理工大学医学院1，骨科研究所2，河南 焦作 454000）

骨水泥（bone cement）由白色粉末和无色带刺激气味的液体两部分制剂组成，其最初用于固定股骨假体，现已广泛用于治疗椎体和股骨颈等部位的骨质疏松[1,2]，最常用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，其可较好地增加椎体强度和缓解疼痛，但存在固化时发热、骨水泥渗漏、体内不能生物降解及骨整合等问题[3]。而磷酸钙骨水泥具有生物相容性、骨传导性好和在局部能自凝固等特点[4]，但同时也存在早期力学性能差、脆性大、降解速度难以控制、不能与新骨生成速度匹配等。有研究表明[5]，羟基磷灰石性质相对比较稳定，具有良好的骨传导性能和生物活性，是一种理想的骨缺损修复材料。同时，纳米级羟基磷灰石更利于与骨组织的整合，骨传导性能、溶解性能以及力学性能更强，且植入动物体内没有物理损害。骨形态发生蛋白是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，它可以刺激DNA 的合成和细胞的复制，促进间充质细胞定向分化为成骨细胞，产生新生骨，具有诱导成骨作用[6，7]。本研究以纳米羟基磷灰石作为主要材料制作骨水泥，观察骨水泥对骨骼生长的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 骨水泥材料 纳米羟基磷灰石2 g、BMP 60 mg、聚酰胺1 g、氢氧化镁5 g、壳聚糖1 g、六水合氯化镁5 g、羟丙甲基纤维素1 g、纳米二氧化硅1 g、无水乙醇5 g、丙酮2 g。

1.1.2 实验材料 健康白色成年新西兰家兔20 只，雌雄不拘，体质量为4.1～4.8 kg，体温38.5 ℃～39.5 ℃，由河南理工大学医学院实验动物房提供提供。饲育室室温（20±3）℃，相对湿度50%～60%，昼夜光照节律12 h∶12 h，兔粮每日食用量为400～500 g，自由饮食水。兔台、灭菌锅、刮胡刀、布巾钳、镊子、刀片、刀柄、直剪、弯剪、止血钳、弯止血钳、纱布、电钻、Alice、针、线、水合氯醛、生理盐水、酒精、碘伏、青霉素。对实验动物的处理与实验目的符合人类的道德伦理标准和国际惯例，符合3R 规则。

1.1.3 骨组织切片的仪器及试剂 切片机（湖北伯纳医疗科技有限公司）、HS-1145 病理组织漂烘仪（金华市华速科技有限公司）、恒温干燥箱、通风橱、奥林巴斯荧光显微镜（奥林巴斯<深圳>工业有限公司）、HE 染色试剂、10%中性甲醛固定液、水杨酸脱钙液、改良Jenkins 脱钙液、1 mol/L 氢氧化钠溶液、盐酸乙醇分化液、剃度乙醇溶液、二甲苯、石蜡、蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 骨水泥制作分别称取羟基磷灰石2 g、聚酰胺1 g、氢氧化镁5 g、壳聚糖1 g、六水合氯化镁5 g、羟丙甲基千维素1 g、纳米二氧化硅1 g、无水乙醇5 g、丙酮2 g，放入研钵充分研磨，研磨充分之后取出放入烤箱60 ℃下烘干，再在空气中进行晾晒，第2 天基本上凝固成型，即可进行骨水泥填充。

1.2.2 兔子实验过程 选取家兔20 只，每5 只为1组，共分为4 组。兔子左侧植入骨水泥复合骨形态发生蛋白材料设为实验组，另一侧植入单纯羟基磷灰石骨水泥材料设为空白组。每只兔子过程相同，首先于术前禁食3 d。配置麻醉药物，取水合氯醛1 g，生理盐水10 ml 混合均匀。将实验兔子放置在手术台，用刮胡刀剃毛，并用剃毛膏去除多余杂毛。在耳缘静脉注射4 ml 麻醉药物，观察兔子反应，10 min 后，如家兔瞳孔仍有反射，补加麻药4 ml，观察家兔瞳孔无反应后即麻醉完全。开始手术，在兔子左股骨手术部位用碘伏消毒，见图1，再用手术刀和镊子接连划开皮肤、布膜、肌肉和骨膜，暴露出骨头，找到股骨，在股骨处钻孔，钻出半径约2 mm 的孔，放入术前制作好的骨水泥，见图2，然后用生理盐水冲洗伤口，并将生理盐水和青霉素混合注射进伤口周围的肌肉，注射3～4 针。随后缝合，用小针缝合肌肉，用大针缝合皮肤，最后用碘伏消毒。实验结束后对兔子日常生活进行观察记录，6 周后进行X光片检查。

图1 股骨处碘伏消毒

图2 复合骨水泥填充

1.2.3 骨切片实验步骤 选取骨水泥手术的家兔，将家兔通过耳缘静脉推注空气致死，取出双侧股骨，剔除多余肌肉组织，放在10%中性甲醛溶液中固定。选择水杨酸脱钙液、改良Jenkins 脱钙液进行脱钙，接着在10%中性甲醛中固定24 h。固定之后选择Jenkins 脱钙液（盐酸4 ml、醋酸3 ml、氯仿10 ml依次加入10 ml 蒸馏水，再加进73 ml 无水乙醇）进行脱钙，脱钙4 d 之后用1 mol/L 氢氧化钠溶液除酸。再用流水冲洗10 min，之后再依次用50%酒精脱水1 h、75%酒精脱水1 h、85%酒精脱水1 h、95%酒精脱水1 h、无水乙醇脱水30 min 2 次。接着进行透明、浸蜡、包埋、切片、展片、捞片、烤片，即用刀片将包有组织的蜡块进行修剪，调试好切片机，装上蜡块，用切片机切成薄片，取较为完整的组织薄片，用镊子轻轻镊起平铺在40 ℃～45 ℃的水面。待蜡片平展后将其捞至载玻片中段，倾掉多余的水，置于60 ℃～65 ℃恒温箱内或漂烘仪烤箱处烤片15～30 min。以上实验结束后开始脱蜡，染色，最后脱水，封片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计数资料以（n）进行描述。

2 结果

2.1 骨水泥填充结果 兔子伤口愈合情况良好，体重较稳定，无异物无免疫排斥反应及其他感染现象发生。术后6 周拍片结果显示，实验组骨缺损间隙模糊，材料体积变小，新骨形成多，并且骨连接紧密；空白组部位有空隙存在，材料变化不明显，见图3。此外，实验组新骨共计生成10 个，界限生成7 个；空白组新骨形成7 个，界限生成5 个；从单个兔子移植骨X 光片结果来看，实验组新骨最多生成3 个，而空白组最多为2 个，见表1。

表1 两组术后6 周移植骨X 光片统计结果（个）

图3 复合骨水泥X 光片

2.2 骨切片结果 实验组染色较浅，另外有较多的新骨组织生成，降解明显；而空白组染色较深，新生骨形成较少，且降解不明显，见图4。

图4 骨切片结果（HE×400）

3 讨论

骨植入材料作为生物材料的重要组成部分，受到临床广泛关注，其中羟基磷灰石因具有优良的生物相容性和生物活性，是一种非常有潜力的骨植入材料。但有研究证明[8]，羟基磷灰石本身不具有促进成骨作用，单纯的羟基磷灰石很难发挥作用，做出来的材料很容易散[9]，需要填充其他物质相互混合来达到目的。骨形态发生蛋白（BMPs）是转化生长因子β（TGF-β）家族中的一员，具有诱导骨形成的作用，与骨骼生物相容性好，亲和力高[10]。据目前研究发现[11,12]，BMP-2、3、4、14 等可用于骨修复，另外通过不同的填充材料，对骨修复的能力也会有不同的影响。BMPs 不单单能单独介导促成骨生长，并且还能与其他骨生长因子混合，以此来增强骨生长的效果。骨形态发生蛋白复合骨水泥与人体骨的构成较为相似，其组成的实验组材料可通过生物活性更好地形成新骨。骨形态发生蛋白骨水泥除了促进生物体的骨组织生长外，对生物体本身也不会造成危害，还具有较好的生物相容性、生物降解以及传导成骨活性，可迅速凝固，不会对机体产生刺激，也不会影响其他材料的生物活性[13]。研究表明[14,15]，骨形态发生蛋白具有传导成骨的作用，而羟基磷灰石有诱导成骨作用，二者结合，相互弥补不足，又同时发挥着自身作用，使实验材料发挥最大的功效。同时，因骨形态发生蛋白具有降解性，最后会随着新骨的形成而被降解。本研究在兔子左右股骨处分别植入骨水泥复合骨形态发生蛋白材料和单纯羟基磷灰石骨水泥材料，结果显示实验组骨缺损间隙模糊，材料体积变小，降解明显，且新骨形成多，骨连接紧密；此外，实验组在新骨和界限生成数量上大于空白组；骨组织切片结果也显示，实验组染色较浅，另外有较多的新骨组织生成，降解明显；而空白组染色较深，新生骨形成较少，且降解不明显，这可能与新骨形成速度与单纯材料降解速度不一致导致的，提示实验组的实验材料具有较高的诱导成骨的活性，使新骨形成的速度大于空白材料降解的速度，因此未有空隙产生。

综上所述，复合材料骨水泥对周围骨组织有促进生长的作用，且对周围骨组织无不良影响，无排斥反应。