不同产地白芷药材质量评价

2021-11-18吴文平索彩仙霍文杰何民友陈向东李国卫

亚太传统医药 2021年10期

吴文平，索彩仙，霍文杰，梁慧，何民友，陈向东，李国卫

(广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山 528244)

《中国药典》2015年版一部收载白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.EtHook.F.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。夏、秋间叶黄时采挖，除去须根和泥沙，晒干或低温干燥。白芷味辛、性温，归胃、大肠、肺经，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓作用。用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛[1]。《名医别录》记载：“生河东川谷下泽，二月、八月采根，曝干；今出近道，处处有，近下湿地，东间甚多。”[2]《图经本草》云：“白芷生河东川东下泽，今所在有之，吴地尤多。”[3]

目前研究发现白芷中化学成分包括香豆素类、挥发油类、多糖类，还有微量元素等，其中香豆素类及其衍生物是白芷的主要成分，其中包括氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、白当归素、珊瑚菜素、佛手柑内酯等。针对白芷中的主要化学成分[4-6]、指纹图谱[7-11]、挥发油[12-14]的组成等均已有文献报道，但较少有文献采用同一色谱条件同时进行含量测定与特征图谱研究的报道较少，本研究采用UPLC法对白芷药材特征图谱及含量测定同时进行研究，特征图谱中共确定11个共有峰，指认7个色谱峰，并对其中6个色谱峰进行含量测定，其中包括：水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素。采用主成分分析、系统聚类分析以及正交偏最小二乘法-判别分析对白芷药材特征图谱进行全面分析[15-18]，为白芷药材质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

Waters H-Class型超高液相色谱仪(美国沃特世公司)；XP26型百万分之一电子天平、ME204E型万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-QDirect 型超纯水系统(美国默克股份有限公司)。

欧前胡素对照品(批号：110826-201616；含量：99.6%)、异欧前胡素对照品(批号：110827-201812；含量：99.6%)由中国食品药品检定研究院提供；水合氧化前胡素对照品(批号：ST22410110MG；含量：98%)由上海源叶生物科技有限公司提供；白当归素对照品(批号：wkq16031401；含量：98%)由四川省维克奇生物科技有限公司提供；佛手柑内酯对照品(批号：17120501；含量：98%)由成都普菲德生物技术有限公司提供；珊瑚菜素对照品(批号：CFN90495；含量：98%)由武汉天植生物技术提供；8-甲氧基补骨脂素(批号：Whar0912；含量：98%)由南京元宝峰医药科技有限公司提供；乙腈、36%乙酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

白芷药材分别采自主产区河北、安徽、山东、河南地区，以家种为主，经广东一方制药有限公司陈向东主任药师鉴定为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.EtHook.F.的干燥根，药材信息见表1。

表1 白芷药材产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent SB C18(2.1 mm×150 mm，1.8μm)，流速为0.35 mL/min；检测波长为300 nm；柱温35 ℃；进样量1μL；以流动相A为乙腈，0.1%乙酸为B，梯度洗脱为0～5.5 min：15%A→28%A，5.5～7 min：28%A→40%A，7～9.5 min：40%A，9.5～15.5 min：40%A→65%A，15.5～15.51 min：65%A→15%A，15.1～18 min：15%A。

2.2 对照品溶液的配制

取水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10、5、4、50、40、20 mg/L的对照品溶液。取8-甲氧基补骨脂素对照品适量，置25 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为40 mg/L的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取白芷药材粉末约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定重量，超声处理(300 W，40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱的建立

2.4.1 精密度考察取同一供试品溶液，按“2.1”项下的的色谱条件连续进样6次，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性考察取同一供试品溶液，按“2.1”项下的的色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性考察取白芷药材S2号样品，按“2.3”项下确定的方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下的的色谱条件进样测定，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 特征图谱分析与评价

2.5.1 特征峰指认及共有峰确定按“2.1”项下的色谱条件分别对供试品溶液和对照品溶液进行测定，通过与对照品保留时间进行比对，确定7个化学成分，分别为水合氧化前胡素(峰1)、白当归素(峰2)、8-甲氧基补骨脂素(峰4)、佛手苷内酯(峰5)、欧前胡素(峰9)、珊瑚菜素(峰10)、异欧前胡素(峰11)，对照品及供试品色谱见图1。采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0版)，对16批白芷药材特征图谱进行分析，建立各自特征图谱并生成指纹图谱共有模式，共确定11个共有峰，见图2。以峰9为参照峰S峰，计算各色谱峰的相对峰面积及RSD值，见表2，各特征峰相对峰面积RSD值在17.84%～94.46%范围内，结果表明不同产地白芷药材特征图谱存在一定差异。

表2 白芷药材的特征图谱相对峰面积

图2 16批白芷药材特征图谱叠加图

2.5.2 相似度评价采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0 版)对16批白芷药材特征图谱进行叠加，进行相似度评价，见表3。结果显示，不同批次白芷药材样品的相似度均大于0.95，表明样品特征图谱与对照图谱的相似度较高，因此，该图谱可做为白芷药材的特征图谱。

注：峰1：水合氧化前胡素；峰2：白当归素；峰4：8-甲氧基补骨脂素；峰5：佛手苷内酯峰9：欧前胡素；峰10：珊瑚菜素；峰11：异欧前胡素。

表3 16批白芷药材样品特征图谱相似度

2.5.3 系统聚类分析运用SPSS 20.0数据处理软件使用Ward聚类方法结合欧式距离系数，对白芷药材特征图谱进行系统聚类分析，结果显示，当欧式距离<5时，白芷药材分为4类，见图3，结果显示：安徽省药材(S3～S9)为第1类，安徽省药材(S1、S2)与山东省药材(S10、S11)为第二类，河南省药材(S14～S15)为第三类，河北省药材(S12、S13)为第四类，同一产地白芷药材均可聚类，但安徽省药材S1、S2与山东省药材S10、S11聚为一类，可能与栽培环境、种植条件、药材加工方式等因素有关系。

图3 白芷药材聚类分析树状图

2.5.4 主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 通过SPSS 20.0 软件对16批白芷药材特征图谱相对峰面积结果进行主成分分析。由表4、表5可知，前3个成分累积方差贡献率为86.166%，基本可以反映白芷药材样品信息。特征图谱主成分1贡献率为55.518%，占比超1/2，其中峰1(水合氧化前胡素)、峰2(白当归素)在主成分1中贡献率最大，峰4(8-甲氧基补骨脂素)在主成分2中贡献率最大，峰7在主成分3中贡献率最大，所以可认为水合氧化前胡素、白当归素、峰4(8-甲氧基补骨脂素)、峰7是影响白芷药材质量的重要因素。根据各主成分得分进行综合评价，其综合得分F=0.555×F1+0.197×F2+0.109×F3，可对16批白芷药材质量进行排序，河北省药材S12、S13综合得分排名为第一、第二位，且综合得分数大于1.0，明显高于其他省份的药材，由此推断河北省白芷药材质量较佳，结果见表6。

表6 白芷药材综合得分结果

为寻找白芷药材产生差异性的主要标志物，采用OPLS-DA对白芷药材样品进行分析，将16批样品各特征峰的相对峰面积导入SIMCA14.0 软件中，获得相应模型，结果见图3。在OPLS-DA模型中，累计解释能力R2Y、R2X分别为0.776、0.552，预测能力参数Q2为0.692，均大于0.5，说明所建立的模型稳定。采用正交偏最小二乘法分析得到各特征峰的VIP值，见图3，结果显示，峰10(珊瑚菜素)、峰2(白当归素)、峰11(异欧前胡素)、峰1(水合氧化前胡素)、峰8、峰5(佛手柑内酯)VIP值均≥1，上述6个特征峰可作为白芷药材质量控制的标志物。

图4 VIP值图

2.6 白芷药材含量测定

由特征图谱主成分分析结果可知，水合氧化前胡素、白当归素、峰4(8-甲氧基补骨脂素)是影响白芷药材质量的重要因素；由特征图谱OPLS-DA分析结果可知，峰10(珊瑚菜素)、峰2(白当归素)、峰11(异欧前胡素)、峰1(水合氧化前胡素)、峰8、峰5(佛手柑内酯)可作为白芷药材质量控制的标志物，因8-甲氧基补骨脂素稳定性较差，故暂不纳入含量测定指标。2015年版《中国药典》白芷项下，将欧前胡素作为白芷药材质量控制的标准。结合以上信息，将峰1(水合氧化前胡素)、峰2(白当归素)、峰5(佛手柑内酯)、峰9(欧前胡素)、峰10(珊瑚菜素)、峰11(异欧前胡素)作为含量测定指标，与特征图谱采用相同色谱条件，进行测定。

2.6.1 线性关系考察分别精密称取水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内脂、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素对照品2.452 mg、2.132 mg、2.258 mg、2.648 mg、2.051 mg、2.239 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作为混合对照品母液。精密吸取上述母液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度线，即得线性混合对照品系列溶液。精密吸取上述混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，以各组分峰面积(Y)与对照品溶液(X，1μg/mL)进行回归处理，得各组分回归方程及线性范围，见表7。

表7 6个化合物的回归方程及线性范围

2.6.2 精密度实验分别精密吸取同一供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积。计算水合氧化前胡素峰面积RSD值为0.21%、白当归素峰面积RSD值为0.22%、佛手柑内酯峰面积RSD值为0.15%、欧前胡素峰面积RSD值为0.12%、珊瑚菜素峰面积RSD值为0.21%、异欧前胡素峰面积RSD值为0.92%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性实验精密吸取同一供试品溶液，分别于0、6、10、15、20、24 h进样，记录峰面积。计算水合氧化前胡素峰面积RSD值为0.57%、白当归素峰面积RSD值为0.65%、佛手柑内酯峰面积RSD值为0.51%、欧前胡素峰面积RSD值为0.38%、珊瑚菜素峰面积RSD值为0.26%、异欧前胡素峰面积RSD值为0.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.4 重复性实验按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，按照“2.1”项下色谱条件。计算水合氧化前胡素含量RSD值为0.54%、白当归素含量RSD值为0.63%、佛手柑内酯含量RSD值为0.86%、欧前胡素含量RSD值为0.79%、珊瑚菜素含量RSD值为0.71%、异欧前胡素含量RSD值为1.00%，表明本法重复性良好。

2.6.5 加样回收率实验取已知含量白芷药材(批号：S2)0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按照1∶1浓度精密加入对照品混合溶液；按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率，结果见表8。

表8 白芷药材加样回收率实验结果

2.6.7 白芷药材样品含量测定结果及分析 16批白芷药材的佛手柑内酯、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素的含量RSD值在15.19%～31.97%范围内，说明不同产地的样品中4种成分的含量较为稳定。水合氧化前胡素含量的RSD值为48.29%，白当归素含量的RSD值为67.43%，波动较大，说明不同产地的样品上述两种成分差异较大。16批样品的水合氧化前胡素的含量均值为0.507 mg/g，白当归素的含量均值为0.295 mg/g，河北产地的样品两种含量均明显高于均值，说明河北产地的白芷样品质量较优；安徽产地的两者含量均接近均值，质量较为稳定；河南产地的样品含量基本低于两者的均值，质量较差。

3 分析与讨论

3.1 色谱条件考察

本实验建立白芷药材特征图谱与指标成分含量同时测定的UPLC方法，分别对不同色谱柱、流动相、柱温、流速、检测波长等因素进行考察，确定最终色谱条件为采用Agilent SB C18(2.1 mm×100 mm，1.8μm)，流动相为乙腈-0.1%乙酸进行梯度洗脱，流速为0.35 mL/min，柱温35 ℃，检测波长为300 nm，分离效果最佳，分析时间短，方法重复性良好。

表9 16批白芷药材含量测定结果

3.2 特征图谱分析

本实验采用UPLC法建立白芷药材的特征图谱并同时测定白芷药材中6个成分含量。白芷药材特征图谱共确定11个共有峰，对其中7个共有峰进行化学成分指认，通过相似度计算得到16批白芷药材对照图谱与各批次样品间相关性较好，相似度可达到0.95以上，说明16批白芷药材间特征图谱相似度高，11个共有峰能在样品中稳定存在。通过对16批白芷药材特征峰的相对峰面积进行分析，从主成分综合得分结果可知，排名前三的药材分别是来自河北省2批，河南省1批，排名前十的结果表明白芷药材分别来自河北省2批，安徽省4批，河南省2批，山东省2批，综合来说，河北省2批白芷药材排名最高，质量最佳；山东省白芷药材质量较稳定，不同批次间差异较小；河南省、安徽省白芷药材整体综合得分排名上中下都有分布，不同批次白芷药材质量差异较大；分析16批白芷药材特征图谱特征峰主成分及6个指标成分的主成分表，发现两者主成分1中均是水合氧化前胡素、白当归素贡献度最大，主成分1又在所有主成分中占比约1/2，说明水合氧化前胡素、白当归素可作为白芷药材决定性成分。根据OPLS-DA分析，筛选出影响白芷药材质量的标志物。从系统聚类分析，发现河北省、河南省白芷药材能聚在一类；安徽省与山东省白芷药材间分类不够明显，可能与药材栽培环境、种植习惯、药材处理方式、采集时间、储存环境等因素有关。因安徽省和山东省同属于华东地区，所处自然环境相似，可能导致部分药材质量相似，区分不明显，而河南属于华中地区，河北属于华北地区，三个地区各有各自的资源特点，环境可能是导致药材质量产生差异的主要原因。

3.3 含量测定分析

《中国药典》2015年版白芷项下，规定欧前胡素含量不少于0.08%，16批样品欧前胡素的含量均值为2.570mg/g，RSD值为21.10%，均符合药典要求，且欧前胡素含量波动差异较小；佛手柑内酯、珊瑚菜素、异欧前胡素的含量RSD值在15.19%～31.97%范围内，而水合氧化胡素、白当归素含量RSD值分别为48.29%、67.43%；特征图谱的主成分分析发现，影响特征图谱主成分1中水合氧化前胡素、白当归素贡献率最大；经特征图谱OPLS-DA也同时分析出水合氧化前胡素、白当归素的VIP值大于1.0，是影响白芷药材质量的标志物；王梦月等[19]对白芷药材中总香豆素的药理作用进行研究，结果发现白芷药材中总香豆素具有抗炎、镇痛和解痉的功效，水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素都属于香豆素类成分，从含量测定结果可知，水合氧化前胡素、白当归素在16批药材含量RSD%值较大，不同产地的白芷药材质量有一定差异，故建议将水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素作为白芷药材含量测定指标成分，更好的控制白芷药材质量。