一种改良的真菌PAS 染色方法

李 娜，陈凤鸣，王 雷

（第四军医大学西京皮肤医院，陕西 西安 710032）

病理检查是诊断深部真菌病的重要手段，快速准确检出真菌对明确临床诊断有着重要意义[1，2]。目前，真菌染色在我国临床各类疾病诊断中应用十分广泛，如真菌感染的皮肤病、各内科疾病的组织细胞染色以及重要脏器感染的诊断等[3-5]。多数真菌在常规苏木素-伊红染色切片上不容易辨认，而PAS 染色是临床中应用最为广泛的特殊染色方法[6]。由于组织内都含有糖原，而研究发现，糖原的存在可导致一些深部真菌感染在进行PAS 染色时因背景着色而影响观察[7]。为此，本研究拟改进PAS 染色方法，以降低染色背景。

1 材料与方法

1.1 试剂 10%铬酸，碱性品红，盐酸，偏重亚硫酸钠，活性炭，改良Gill 苏木素染液，0.2%亮绿，1%盐酸酒精，无水乙醇，二甲苯，中性树胶。

1.2 染液配制 10%铬酸氧化液：10 g 三氧化铬加入90 ml 蒸馏水中，摇匀使其完全溶解，保存于4 ℃冰箱。0.5%高碘酸氧化液：0.5 g 高碘酸加入100 ml 蒸馏水中，摇匀使其完全溶解，保存于4 ℃冰箱。0.2%亮绿：0.2 g 亮绿加入100 ml 蒸馏水中，摇匀使其完全溶解，加入0.2 ml 冰醋酸，保存于4 ℃冰箱。Schiff液：0.5 g 碱性品红溶于100 ml 煮沸的蒸馏水中，煮沸5 min，溶液冷却至50 ℃，加1 当量盐酸10 ml，待温度冷却至25 ℃时，加0.8 g 偏重亚硫酸钠，摇荡2 min，置于暗处18～24 h，加3 g 活性炭静置1～2 h 过滤，溶液呈无色或浅草黄色可用。4 ℃避光密闭保存。

1.3 染色步骤 组织经福尔马林固定，切片厚4 μm，脱蜡至水。采用不同浓度的铬酸溶液或高碘酸溶液氧化反应10 min，蒸馏水洗涤3 次。用Schiff 液滴染15～60 min，倾去Schiff 试剂，流水冲洗。用亮绿染色液复染1 min，或者用改良Gill 苏木素染液复染2～3 min，流水冲洗，返蓝后常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 方法

1.4.1 比较亮绿与苏木素衬染 取2 张连续切片的深部真菌病染色切片按上述染色步骤进行染色，分别以亮绿与苏木素衬染，比较菌丝及孢子与周围组织对比是否分明，背景是否清晰。

1.4.2 比较不同浓度铬酸溶液氧化后的染色 取3 张连续切片的深部真菌病染色切片，分为A、B、C 三组，按上述染色步骤进行染色，A 组铬酸溶液浓度5%，B 组铬酸溶液浓度10%，C 组铬酸溶液浓度20%，各氧化10 min，比较三组染色结果的阳性强度，阳性区域比周围组织对比是否分明，背景是否清晰。

1.4.3 比较Schiff 溶液染色不同时间对结果的影响取3 张连续切片的深部真菌病染色切片，分为A、B、C 三组，以10%铬酸溶液，按上述染色步骤进行染色，A 组Schiff 溶液时间15 min，B 组Schiff 溶液时间30 min，C 组Schiff 溶液时间60 min，比较三组染色结果的阳性强度，阳性区域比周围组织对比是否分明，背景是否清晰。

1.4.4 确立最终的改良条件 将浓度10%的铬酸氧化10 min，Schiff 溶液染色30 min。采用多种真菌感染病理切片进行验证染色方法是否可靠。取体癣、脓癣、以及深部真菌病各一张切片，以浓度10%的铬酸，Schiff 溶液30 min 进行染色，亮绿衬染，观察皮肤组织内的菌丝及孢子与周围组织对比是否明显，背景是否清晰。

2 结果

2.1 亮绿与苏木素衬染比较 以常规PAS 染色比较亮绿与改良Gill 苏木素染液衬染，发现苏木素衬染背景为淡粉色，菌丝及孢子为紫红色，与周围组织不易区分。而亮绿衬染背景为绿色，菌丝及孢子为紫红色与周围组织对比明显，易于辨认，见图1。

图1 苏木素与亮绿衬染的PAS 染色对比

2.2 不同浓度的铬酸溶液氧化后染色效果比较 浓度为5%的铬酸溶液组皮肤组织背景干净清晰，但其中的菌丝及孢子着色偏浅，与周围组织不易区分；浓度为10%的铬酸溶液组皮肤组织内的真菌着色呈紫红色，颜色鲜艳，周围的纤维结缔组织及炎细胞为绿色能明显区分，背景干净清晰；浓度20%的铬酸溶液背景干净清晰，但其中的真菌不着色，未见明显的菌丝及孢子，见图2。

图2 PAS-铬酸染色不同浓度铬酸溶液染色对比

2.3 Schiff 溶液染色不同时间的结果比较 Schiff 溶液15 min 组皮肤组织背景清晰，纤维结缔组织及炎细胞为绿色，但菌丝及孢子着色偏浅；Schiff 溶液30 min 组皮肤组织背景清晰，纤维结缔组织及炎细胞为绿色，菌丝及孢子为紫红色；Schiff 溶液60 min组皮肤组织的背景较清晰，为绿色背景中夹杂着粉色，菌丝及孢子为紫红色，见图3。

图3 PAS-铬酸染色Schiff 溶液不同染色时间对比

2.4 验证试验 采用浓度10%的铬酸，Schiff 溶液30 min，并以亮绿衬染染体癣、脓癣、以及深部真菌病，可在组织内见到染色对比度良好的真菌，证明该染色方法质量可靠。PAS-铬酸染色结果显示体癣位于角质层为紫红色，其中的菌丝呈淡紫色对比明显，易于辨认；脓癣位于毛囊内的孢子为淡紫色，而其中的角质物质为紫红色，对比较明显，易于辨认；深部真菌病位于真皮的菌丝及孢子呈紫红色，周围纤维结缔组织及炎细胞为绿色，对比明显，易于辨认，见图4。

图4 体癣、脓癣及深部真菌病PAS-铬酸染色图

3 讨论

既往传统的PAS-过碘酸染色采用的是苏木素衬染[8，9]，该方法利用过碘酸作用将两个相邻碳的羟基氧化为醛基，而Schiff 试剂可与醛基发生染色反应。目前，大量的实际真菌染色实验报道对PAS-过碘酸具体染色效果进行了分析。如Margo CE 等[10]的研究报道了对传染性结晶性角膜病变患者利用PAS-过碘酸染色进行角膜组织液染色的研究，发现在部分患者的组织液样本染色中能够观察到真菌，但在感染不强的患者中并不能获得明显的染色效果；Zaaroura H 等[11]对195例手足癣患者进行了组织活检染色，发现PAS-过碘酸染色呈阳性的患者仅有6例，且根据组织染色结果的反应模式认为这些患者不容易被归类为具体的疾病类型；而Adriana GP 等[12]针对PAS-过碘酸染色进行了系统性的效果分析，纳入了皮肤、眼部以及其他真菌感染患者的组织样本进行染色，发现虽然PAS-相邻背景呈淡红色，但从真菌与周围组织的对比效果来看，有相当一部分患者的样本染色效果并不明显，导致真菌感染情况不易辨认。上述研究结果显示，PAS-过碘酸染色方法在真菌染色的效果上并不十分理想。

从染色原理上来看，PAS-过碘酸染色具体的原理是将高碘酸作为氧化剂，氧化糖类及有关物质中的1，2-乙二醇基，使之变为二醛，醛与Schiff 试剂结合生成一种品红色化合物，于多糖存在的部位形成新的紫红色复合物[13-15]。因此，PAS 染色能广泛显示糖原、胶原、基底膜带，真菌孢子及菌丝较难分辨[16-18]。但由于该方法在真菌染色过程中暴露出的不稳定性缺点，利用该方法无法为部分患者提供准确的染色诊断效果[19，20]，而本研究通过将改良Gill苏木素染液换为亮绿染液，背景为绿色，菌丝及孢子呈紫红色，使染色效果更易于辨认[21-23]。

本研究主要将过碘酸换成了铬酸，主要原因如下：①铬酸作为氧化剂时在多糖中产生醛类物质，在浓度最高的区域完全转化需要更长地时间，使这些多糖与Schiff 试剂反应，这就意味着样本组织内的真菌将会获得更长时间的染色反应；②由于真菌的细胞壁富含1，2-乙二醇基团，采用铬酸来替代过碘酸可使真菌在组织切片上比大多数其他活性成分着色更强烈。通过实验结果可以观察到，铬酸使真菌和背景之间的对比往往比PAS-过碘酸染色的重复部分更明显。以往国内外也报道了关于PAS-过碘酸染色的改进方法，如Chawla M 等[24]将PAS 染色和荧光成像分析结合应用，可观察到绒毡层和小孢子的具体发展进程，但这种改进方法并未对染色过程本身进行改进，实际上并未获得更好的染色效果。杨伟平等[25]利用50 ℃摊烤片机预处理与组织冷冻切片相结合的方法进行真菌染色，结果发现该方法明显缩短了时间，且真菌薄膜染色对比度更加鲜艳，这种改进方法避免了环境温度对过碘酸产生的长时间影响，使染色能在3 min 内达到较好效果。本研究将传统PAS 染色中的过碘酸换成了铬酸溶液，且研究了不同浓度的铬酸溶液及Schiff 溶液不同的染色时间对PAS-铬酸染色的影响，结果表明以10%浓度的铬酸溶液及Schiff 溶液30 min 染色效果为最佳，此时皮肤组织中的真菌着色呈紫红色，颜色鲜艳，与周围的纤维结缔组织及炎细胞能明显区分，背景干净清晰。在未考虑温度因素的影响，利用铬酸使Schiff 试剂与醛基之间获得了更长的反应时间，也收获了类似的染色效果。

另外，本研究采用改良PAS-铬酸染色，并以亮绿衬染，对皮肤科常见真菌感染性疾病体癣、脓癣，以及其他深部真菌病进行验证后发现该染色方法的皮肤组织中的真菌着色呈紫红色，背景呈绿色，与周围的纤维结缔组织及炎细胞能明显区分，质量可靠，对比度较高，可用于临床检测。

综上所述，改良的PAS-铬酸染色方法比经典的PAS 染色方法背景更干净，染色对比度较高。