GeneXpert MTB/RIF系统对结核病诊断价值的回顾性分析

陈 晶，丘 文，苏 冰，胡秀梅，林 丽，周 芳，肇恒瑞，芮勇宇

南方医科大学南方医院检验科，广东广州 510515

结核病是由结核分枝杆菌复合菌群引起的一种慢性传染病，是我国的乙类传染病，以炎性渗出、增生和干酪样坏死为主要病理变化。世界卫生组织发布的《全球结核病报告》指出结核病是世界上最重要的传染性疾病之一，被认为是全球十大死亡原因之一[1]。早期发现结核病是成功治疗和减少疾病传播的关键。全球结核分枝杆菌潜伏感染的人数约17亿，占世界人口总数的1/4左右，每年新发结核病患者均在1 000万例左右。而我国的结核病新发病例数位列第二(9%)，仅次于印度(27%)，此外，肺外结核的发病率也呈现逐年上升的趋势[2]。

结核病的治疗以化疗为主要手段，如今耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐多药结核病(XDR-TB)对结核病的防控带来了严峻的挑战。因此，早期诊断和治疗结核病，以及采取有效的公共卫生措施，对结核病患者预后至关重要。结核病发病率居高不下，这很大程度上是因为结核病的诊断方法的局限性[3]。结核病的诊断主要通过询问病史和症状体征，影像学、免疫学和病原学检查等多种方法综合运用。结核病常用的实验室检查方法有抗酸染色镜检、结核菌素试验、罗氏培养法、γ-干扰素释放(IGRA)试验、血清结核分枝杆菌免疫球蛋白(Ig)G抗体检测、结核分枝杆菌基因(TB-DNA)扩增检测，以及近年来受到广泛应用的GeneXpert MTB/RIF结核分枝杆菌鉴定。本文将GeneXpert MTB/RIF结核分枝杆菌鉴定技术与几种常用的检测方法进行比较，回顾性分析和评价几种检测方法的效能。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取南方医科大学南方医院2020年1-5月进行GeneXpert MTB/RIF结核分枝杆菌鉴定的住院患者669例为研究对象，其中男430例，女239例；年龄2～92岁；检测住院患者标本中自然咳痰363例，肺泡灌洗液266例，胸腔积液21例，脑脊液6例，穿刺液4例，抽吸痰3例，引流液2例，粪便2例，腹水1例，中段尿1例。经鉴定有113例住院患者(男73例，女40例)诊断为结核病患者，556例(男357例，女199例)诊断为非结核病患者，纳入和排除标准均根据《肺结核诊断：WS288-201》相关标准执行[4]。669例住院患者中39例进行了结核菌素试验，66例进行了结核分枝杆菌IgG抗体检测，189例进行了罗氏培养法检测，286例进行了TB-DNA扩增检测，35例进行了IGRA试验，667例进行了涂片抗酸染色镜检。

1.2仪器与试剂 GeneXpert分子诊断系统购自美国赛沛公司；IGRA检测试剂盒购自德国Qiagen公司；冷染法抗酸染色液试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司；结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒购自新加坡MP生物医学亚太公司；结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒购自德国Qiagen公司(PCR-荧光探针法)；结核分枝杆菌纯蛋白衍生物试剂、酶标仪购自北京祥瑞生物制品有限公司。

1.3方法

1.3.1GeneXpert MTB/RIF试验 吸取2 mL标本处理液于前处理管中，加入1 mL标本(标本应不含食物颗粒和血液)，旋紧盖子后置于振荡器上充分混匀10～20 s，直至标本充分液化，无肉眼可见的固体物质存在。将2 mL处理后的标本缓慢加入Cartridge反应盒内(防止气泡产生)。将Cartridge反应盒放于GeneXpert仪器中进行检测，仪器将自动完成核酸提取、纯化、扩增等过程，待反应完成后，系统自动判读结果。

1.3.2结核菌素试验 75%乙醇消毒注射部位，用1 mL注射器抽取0.1 mL 结核菌素(5 IU)，注射于前臂掌侧中下端1/3交界处，避开疤痕、血管和褶皱，注射处呈直径约为6～10 mm的白色隆起，72 h后观察结果。结果判断标准：无反应或仅有轻微红晕，硬结直径<5 mm者为阴性；硬结直径≥5 mm或有水疱、坏死、溃疡、双圈、淋巴管炎等均判断为阳性。

1.3.3结核分枝杆菌IgG抗体检测(胶体金法) 将25 μL血清标本加入加样孔，当标本迁移至蓝色指示线时，加入3滴缓冲液至椭圆孔。拉出分离片，再加入1滴缓冲液于加样孔，15 min后判读结果。判读结果时，确保质控线处有紫色条带，如果在测试线处有紫色条带则判读为阳性，若仅有质控线处有紫色条带，则判读为阴性。

1.3.4抗酸染色镜检 将标本充分混匀后，取适量标本于玻片正面均匀涂抹成10 mm×20 mm左右的形状。自然干燥后，用酒精灯火焰固定后进行萋-尼氏染色。在高倍镜下，连续观察300个不同视野，采用世界卫生组织的6层报告方式判读结果。

1.3.5罗氏培养法 将痰液等标本做去污染处理后，取标本0.1～0.3 mL，接种于罗氏固体斜面培养基上。体液类标本离心后直接接种于罗氏培养基上。将接种好的罗氏培养基置于37 ℃、5%CO2的温箱中培养。

1.3.6IGRA试验 将肝素锂抗凝全血1 mL分别加至测试管、阳性对照管、阴性对照管中，于37 ℃孵育24 h。离心后取上清液，通过酶联免疫吸附试验检测γ-干扰素，450 nm波长的条件下读取各孔吸光度值，按试剂盒说明书要求对结果进行判读。

1.3.7TB-DNA扩增检测 标本中加入适量NaOH溶液，摇匀后置室温下液化至无固态物质，取1.0 mL于小型离心管中，12 000 r/min离心5 min，留沉淀加1 mL生理盐水混匀。相同条件离心5 min。1 mL水洗涤沉淀，再次离心。留沉淀加50 μL样品提取液充分混匀。100 ℃水浴15 min后，离心5 min。上清液作为PCR反应模板。PCR反应后取样品管于荧光仪中分析，记录数据。

1.4统计学处理 采用SPSS23.0统计软件对数据进行处理和分析，计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用诊断性试验比较GeneXpert MTB/RIF试验、IGRA试验和TB-DNA扩增检测这3种检测方法对结核分枝杆菌感染的诊断价值；绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估其诊断效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各种结核分枝杆菌检测方法的诊断评价 以临床最终诊断为金标准，7种检测方法的灵敏度排前三位的是IGRA试验(83.33%)、GeneXpert MTB/RIF试验(53.98%)和结核菌素试验(38.89%)；与GeneXpert MTB/RIF试验灵敏度比较，IGRA试验、结核菌素试验灵敏度差异均无统计学意义(χ2=1.987、1.417，P>0.05)，结核分枝杆菌IgG抗体检测、TB-DNA扩增检测、抗酸染色镜检灵敏度均较低(χ2=8.754、11.625、54.849，P<0.05)。

7种检测方法的特异度从高到低依次是罗氏培养法/TB-DNA扩增检测、GeneXpert MTB/RIF试验/抗酸染色镜检、结核分枝杆菌IgG抗体检测、结核菌素试验、IGRA试验。与GeneXpert MTB/RIF试验特异度比较，罗氏培养法、TB-DNA扩增检测、抗酸染色镜检特异度差异均无统计学意义(χ2=0.541、0.837、0.000，P>0.05)，IGRA试验、结核菌素试验、结核分枝杆菌IgG抗体检测特异度均较低(χ2=237.881、143.289、89.313，P<0.05)。GeneXpert MTB/RIF试验具有较高的准确度，而结核菌素试验的准确度最低。见表1、2。

表1 各种结核分枝杆菌检测方法的结果(n)

2.2GeneXpert MTB/RIF试验、IGRA试验和TB-DNA扩增检测结核分枝杆菌的ROC曲线分析 GeneXpert MTB/RIF试验、IGRA试验和TB-DNA扩增检测的曲线下面积(AUC)分别为0.769、0.738、0.636，见图1。

表2 各种结核分枝杆菌检测方法对结核感染的诊断价值评价

图1 3种检测方法的ROC曲线

3 讨 论

结核菌素试验、结核分枝杆菌IgG抗体检测与IGRA试验这3种检测方法，都是以机体的免疫反应来检测是否感染了结核分枝杆菌。本研究中IGRA试验的阴性预测值和灵敏度分别为93.75%和83.33%，是3种方法中检测效果最佳的，这与相关研究一致[5]。然而，这3种检测方法的阳性结果并不能确诊活动性结核病，只能反映感染过结核分枝杆菌。此外，接种卡介苗也会使结核菌素试验和结核分枝杆菌IgG抗体检测呈现阳性结果，阴性也不能排除未感染结核分枝杆菌，仍有较多情况导致假阴性结果的出现，如感染初期机体还未产生免疫应答或免疫缺陷，可能会使患者细胞免疫功能降低。而IGRA试验使用的是结核分枝杆菌的特异性抗原ESAT-6和CFP-10来刺激体内激活的特异性T淋巴细胞，这在很大程度上保证了结果的特异度，且接种卡介苗不会引起假阳性反应[6]。虽然IGRA试验的灵敏度和阴性预测值均较高，但依然有一定的漏诊率。研究发现，高龄和外周血淋巴细胞数目过低是导致IGRA试验假阴性的重要因素[7]。甚至有部分IGRA试验阴性结果是由于这类人群对结核分枝杆菌未产生任何适应性免疫反应，或是产生独立于干扰素的免疫反应[8]。另外，IGRA试验不能区分活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染，但在这3种检测方法中，推荐IGRA试验为首选的结核病检测方法，IGRA试验阴性预测值可以用来对结核病进行排除性诊断，当检测结果为阳性时，还需结合其他辅助检查和临床表现来综合判断。

GeneXpert MTB/RIF试验、罗氏培养法、TB-DNA扩增检测和抗酸染色镜检同属于病原学检测手段，其检测特异度均较高[9]。抗酸染色镜检方便快捷，该方法的阳性结果对结核病的诊断有极大的参考价值，但其灵敏度低，每毫升标本中至少含5 000～10 000个细菌时才能呈现抗酸染色镜检阳性结果。本研究669例患者中，有667例同时进行了抗酸染色镜检和GeneXpert MTB/RIF试验，两种方法的检测结果差异有统计学意义(P<0.05)，但抗酸染色镜检阳性不能确定标本中的细菌即为结核分枝杆菌。本研究中罗氏培养法灵敏度仅为2.56%，在189例同时进行了罗氏培养法检测和GeneXpert MTB/RIF试验的患者中，罗氏培养法检测结果只有1例为阳性。另外，罗氏培养法虽然含有孔雀石绿等成分可抑制杂菌生长，但其污染率仍较高，导致培养结果受到干扰[10]。

GeneXpert MTB/RIF试验和TB-DNA扩增检测都是应用PCR原理的检测手段。GeneXpert MTB/RIF试验的灵敏度明显高于TB-DNA扩增检测[11]，且GeneXpert MTB/RIF试验自动化程度高、检测时间短、操作难度小、安全性高，能够针对性地检出是否含有利福平耐药基因，是其他几种方法所不具备的优势。但GeneXpert MTB/RIF试验仅对利福平耐药基因rpoB是否突变进行检测，针对常见的异烟肼耐药基因inhA和katG，该方法并不能检出，对MDR-TB和XDR-TB可能会漏诊[12]，这很大程度上限制了该方法的应用。此外，GeneXpert MTB/RIF试验的灵敏度还有待提高。研究发现，在肺外结核中，GeneXpert MTB/RIF试验的灵敏度和特异度不够理想[13]。尤其是在结核性脑膜炎中，GeneXpert MTB/RIF试验的阴性结果并不能很好地排除结核，这可能与脑脊液标本中的含菌量较少有关[14]。本研究中未能收集到人类免疫缺陷病毒与结核分枝杆菌双重感染的患者标本，人类免疫缺陷病毒与结核分枝杆菌双重感染的患者由于自身免疫系统受损，往往结核的免疫学检测会出现假阴性而导致漏诊，但过去的研究表明GeneXpert MTB/RIF试验在这类患者中也有良好的表现[15]。由于本院并非结核病定点医院，结核病标本数量，尤其是耐药性结核病标本数量较少，本研究未能对GeneXpert MTB/RIF试验诊断耐药性结核病的效能进行评价。但有研究表明该方法对利福平耐药检测的阳性预测值不高[13]，因此是否需要对该方法检测的利福平耐药结果进行传统方法的验证，还需进一步研究。

综上所述，在免疫学检测方法中，因IGRA试验的灵敏度和阴性预测值均较高，推荐使用其进行结核病的初筛，通过IGRA试验进行疑似结核病的排除能起到较好的效果。而在病原学检测方法中，GeneXpert MTB/RIF试验具有良好的特异度和准确度，推荐使用其作为结核病的确诊手段[16]。为提高检测方法的灵敏度，良好的标本采集、运输和保存等环节对结果起着至关重要的作用。如留取痰液标本时，受检者应清晨以清水漱口后，用力咳出的深部痰(脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液)为较合格的标本，以3～5 mL为宜。肺外结核病应留取病变部位的穿刺液、引流液等。另外，影像学方法对结核病的诊断也十分重要。影像学、实验室检验方法和临床表现在结核病的诊断上均有着关键作用，需要综合分析才能对结核病进行早诊断、早治疗。