植物露酒中黄酮类化合物功效及检测技术研究进展

黄婷，刘茗铭，王媚，冯方剑，赵金松,*

1(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾，644000) 2(四川省酒业集团有限责任公司 川酒研究院，四川 成都，610000)

露酒又称配制酒，是一种以发酵酒、蒸馏酒或食用酒精为酒基，加入食用或药食两用的动植物精华，经再加工而成，改变了原酒基风格的酒种[1]。露酒按不同成分可分为植物露酒、动物露酒及动植物露酒和其他类露酒，其中植物露酒，是在选定的酒基中，加入药食两用的植物，进行浸提、调配、混合或再加工而成的、具有一定保健功能和特定植物香的饮料酒[2]，是中国露酒工业的重要组成部分。

植物露酒不仅具有相应的植物香和酒香，且多种功能活性因子的存在，使其还具有特定的保健功能，符合了当代人追求健康生活的需求，其中黄酮类活性成分在植物露酒中占比较大。近年来，国内外学者对其研究越来越深入，目前已被发现黄酮类物质赋予植物露酒的功能特性主要有抗氧化、抗癌、降血脂、抗疲劳、抗菌等生物活性[3]，促使黄酮类化合物功能性研究成为植物露酒研究的热点之一。但由于植物露酒原料来源广泛，致使不同植物露酒中黄酮类化合物种类和含量差异较大，难以形成通用标准，导致植物露酒品质参差不齐。因此，快速准确的定量检测分析技术对植物露酒中黄酮类化合物研究具有重要意义。本文综述了植物露酒中黄酮类物质的功能特性及其定量检测分析技术的研究现状，并对国内外植物露酒黄酮类化合物研究的发展趋势进行预测，旨在为植物露酒功能性研究及检测分析技术提供参考。

1 植物露酒的发展趋势

植物露酒以其个性化的外观、淡雅的口感及特殊的功能性满足了人们生活多样化需求，得到了消费者的青睐。近年由于国外露酒(利口酒)款式新颖，口味多样深受国人喜爱。例如市售火爆的野格利口酒、百利甜酒等。国外进口利口酒涨幅惊人，数据显示，从2015年的4 480.78 kL逐渐增长到了2018年的9 205.92 kL，每年平均增长速率大约为28%，2018年到2019年利口酒进口量达到了23 625.12 kL，同比增长速率可达157%左右，与2015年进口量相比，增长了5.3倍(图1)[4]。相反，据中国海关数据显示[5]，2019年中国白酒的出口量从2018年的1 721.0万L减少到1 638.6万L，同比增长速率为-4.8%(图2)。

图1 国外利口酒进口量及增长趋势Fig.1 Imports and growth trend of foreign liqueur

图2 中国白酒出口量及增长趋势Fig.2 Exports and growth trend of Chinese Baijiu

可见，国内露酒需求量正在不断攀升，而中国白酒出口量有所下降，全球对露酒等酒种的需求量在不断增加。因此，国内与之相关的生产企业需要加大研发力度，促使露酒行业快速发展，满足人们对露酒产品的特殊需求。其次，植物露酒又是主力军，为保证品质，对其质量和有效成分的把控尤为重要。

2 植物露酒中黄酮类化合物种类及其功能特性

黄酮类化合物(flavonoids)是在水果、蔬菜、谷物、树皮、根茎叶和植物露酒中发现的天然苯基色酮类化合物，泛指两个芳环(A环、B环)之间以一个三碳链相连的一系列化合物的总称，其骨架可以表示为C6-C3-C6，在植物体内，葡萄糖分别经过乙酸、丙二酸途径和莽草酸途径生成乙酸和羟基桂皮酸，合成前体物质查尔酮，进一步氧化脱氢形成黄酮类化合物[6]。其主要分为异黄酮类(isoflavones)、异黄烷酮类(isoflavanones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷酮(flavanones)、黄酮类(flavones)、花色素类(anthocyanidins)以及黄烷醇类(flavanols)、查尔酮类(chalcones)、橙酮类(aurones)和双黄酮类(biflavones)。目前，黄酮化合物种类及其功能特性在植物露酒中的应用见表1。

表1 植物露酒中黄酮类化合物种类及其功能特性Table 1 Types and functional characteristics of flavonoids in plant liqueur

3 植物露酒中黄酮类化合物功能特性研究

抗氧化、降血脂和抗癌(肝癌)等功能性是饮酒人最关注的问题，也是当下植物露酒品质研究的重要内容。因此，对黄酮类化合物的功能性评价是新型植物露酒研制过程中不可或缺的环节，也是植物露酒质量和功能性的重要保障。

3.1 抗氧化活性

抗氧化活性是目前研制新型植物露酒时，重点考察的功能性指标之一。研究发现，在一定反应体系下，黄酮类化合物浓度越高时，该植物露酒的抗氧化活性就越强[16]，促使露酒中黄酮类化合物的抗氧化机理研究得到进一步发展，即主要通过抑制自由基的产生实现抗氧化功能，其独特的多羟基结构能与机体代谢产生的自由基相结合，达到阻止细胞退化、衰老的目的。如当人们摄入过量的脂肪类食物时，以植物露酒为佐餐，能有效降低冠心病的发病率，原因是酒中黄酮类物质减少了脂质代谢产物，达到抗氧化的作用，有效防止了动脉粥样硬化；另外，植物露酒中黄酮类化合物的多个芳环(A环、B环)和酚羟基等结构使其能与蛋白质结合，作用于星型胶质细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)蛋白，促进LDH的体外释放，达到抗氧化的目的[17]。

植物中黄酮类化合物在露酒中能够充分发挥其抗氧化活性。淫羊藿是一种富含黄酮类化合物的药用物质，张翔等[16]以淫羊藿为原料，研制保健类植物露酒，在最优浸提条件下，该露酒中总黄酮含量为297.08 mg/L，与普通植物露酒相比，淫羊藿露酒抗氧化能力更强，且随着淫羊藿露酒黄酮类化合物浓度在反应体系中不断增加，其对DPPH自由基的清除能力逐渐提高。另外，方堃等[18]通过对蓝莓露酒的DPPH自由基清除能力评价，确定了该露酒的最佳浸提工艺条件(料液比1∶1、乙醇体积分数60%、超声波时间40 min)，当黄酮类化合物质量浓度为(2.414±0.314) mg/mL时，所得植物露酒的DPPH自由基清除率高达66.3%。在植物露酒抗氧化评价试验中，可通过对酒中黄酮类化合物的含量测定，初步判定该酒的抗氧化活性强弱。

表2 植物露酒抗氧化功能性评价研究进展Table 2 Research progress on functional evaluation of plant liqueur

现阶段，随着抗氧化活性研究不断深入，特定自由基检测试剂盒[19]将广泛用于新型植物露酒功能性评价。

3.2 抗菌活性

高乙醇体积分数(75%)的植物露酒本身具有一定的抗菌能力，但市售的植物露酒因考虑口感，一般将乙醇体积分数设为45%左右，使乙醇赋予植物露酒的抗菌能力有所不足。随着对植物露酒中黄酮类物质研究越来越深入，得知黄酮类物质的抗菌活性可有效弥补植物露酒低乙醇浓度导致的抗菌能力不足，目前露酒中黄酮类物质抗菌研究已成为植物露酒功能性探索的重要组成部分。

到目前为止，已有研究表明沙苑子中含有大量的黄酮类物质，如沙苑子苷、紫云英苷、山奈酚等，具有一定的抗菌活性。范学辉等[24]利用沙苑子为原料，加入一定量的白砂糖，按照料液比为1∶60(g∶mL)进行沙苑子酒的研制，并采用滤纸片扩散法深入研究了该酒的抗菌活性，结果发现，沙苑子酒的抗菌活性来自该酒中的黄酮类化合物，其对葡萄球菌类(Staphylococcus)、芽胞杆菌类(Bacillus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)均有一定的抑制效果，但对红葡萄酵母菌(Saccharomyces)的抑制能力较弱；其次，以红葡萄酒酵母菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌为指示菌，研究温度和金属离子等外界因素对沙苑子酒抑菌活性的影响：随着试验体系温度不断上升，其对3种菌类的抑制作用呈逐级递增趋势(25～121 ℃)；Fe2+对3种菌类的辅助抑制能力显著，Cu2+对大肠杆菌和枯草芽胞杆菌无辅助抑制作用，但对红葡萄酵母菌有一定辅助抑制作用。尹明[25]发现，苦荞蔓越莓果露酒对部分细菌类、霉菌类以及真菌类均有很强抑制作用，对酿酒酵母抑制圈直径可达25 mm左右，随着酒中的黄酮类化合物浓度不断增加，抑菌能力就越强，即其抑菌能力与黄酮类物质浓度呈正相关。

植物露酒抗菌能力评价主要是通过观察微生物抑菌圈直径。抑菌圈法又称扩散法，一种使用待测植物露酒酒样在固体琼脂培养基表面扩散，抑制周围微生物生长并形成透明圆圈(即抑制区)的方法，主要包括滤纸片扩散法(Kirby-Bauer test，K-B法)、牛津杯法和打孔法[24-25](表3)，其中滤纸片扩散法和打孔法已经用于植物露酒抗菌活性评价，为植物露酒抗菌能力研究提供一定的参考价值。

表3 三种抑菌圈研究法的比较Table 3 Comparison of three methods of inhibition zone

3.3 抗癌活性

刘阿文等[21]发现，富含黄酮类化合物的植物露酒适量摄入能够降低人类患癌的机率，其对癌症的抑制机制主要表现在诱导癌细胞凋亡，干预核因子信号传导，抑制癌细胞增殖、增强抑癌基因活性及抑制致癌物质代谢等方面[26]。VERMA等[27]在特定致癌物导致雌性大鼠患乳腺癌的试验中发现，与对照组相比，当它们食用含有5%槲皮素的饮食时，肿瘤数量减少了50%，且能够抑制耐药基因活性表达，达到辅助抗癌效果。黄酮类化合物(槲皮素、山奈酚、芹菜素等)也是植物露酒的主要健康因子，其中山奈酚可抑制转录激活因子 (AP-1)活性，达到协助抗癌的目的；芹菜素能够抑制蛋白质复合物(NF-κB)活性和环氧化酶(COX)活性，协助诱导癌细胞凋亡[28]。此外，黄酮类化合物还能抑制蛋白酪氨酸激酶(PTK)，抑制癌细胞、分裂，进而产生抗癌活性[29]。

近年来，关于植物露酒抗癌活性，相关学者展开了一系列研究。刘阿文等[21]以酱露酒(一种以植物大豆为原料加工而成的植物露酒)为研究对象，通过体外实验对其抗癌活性进行研究，结果发现，酱露酒中不同黄酮类化合物含量对肝癌细胞HepG2和大肠癌细胞HT29的生长抑制作用有所不同，即酱露酒中黄酮类含量越高，对肝癌细胞HepG2和大肠癌细胞HT29的生长抑制率越强，在此研究中,50%酱露酒中黄酮类化合物含量最高可达(126.29±1.88)g/g，该酒对肝癌细胞HepG2生长抑制率最高可达(18.22±1.20)%，对大肠癌细胞HT29的生长抑制率最高可达(42.61±2.13)%，且不同酒精度的酱露酒对肝癌细胞HepG2和HT29的抑制率呈显著性差异。此外，研究发现虫草补酒和鹤龄春酒两种露酒不仅风味独特，且具有预防肿瘤的作用[30]。

目前植物露酒抗癌评价最常用的方法是体外抑制癌细胞增殖试验[21]。

3.4 抗疲劳功能

随着人们生活节奏的加快，人们的精神状态持续处于紧绷状态，身体疲惫不堪， 导致这种疲劳状态的主要原因是以下的理论假设，包括能量大脑皮层神经保护理论、能量消耗理论、氧自由基-脂质过氧化理论和代谢物积累理论[31]。显而易见，人之所以产生疲劳感，是因为身体得不到有效休息，进而破坏了机体本身恢复功能，造成亚健康的状态，随之各种慢性疲劳综合症(猝死、失眠、体虚等)给人类健康带来威胁。

植物露酒中的活性成分具有抗疲劳的功能。刘敏等[32]发现五味子酒中黄酮类化合物含量最高，用不同含量的黄酮类化合物的五味子酒对小鼠进行灌胃实验，五味子酒能明显降低血液中的血尿素氮和血乳酸含量，表现为延长小鼠疲劳时间、减少跑步机电击次数(反映出小鼠抗疲劳能力)，表明五味子酒可提高小鼠抗疲劳能力。方昊[33]以黄酒为酒基，以生晒参、甘草、桂花为原料，筛选出非发酵配伍的复合配方，制成复配植物露酒，并研究其抗疲劳能力，该复方露酒中黄酮类化合物与人参皂苷含量最高，且均具有抗疲劳能力。

疲劳会导致人体出现多种不良现象，如体重偏高或偏低，血尿素氮和血乳酸含量增加，肝糖原储存能力下降等，已有研究根据上述不良现象总结了植物露酒抗疲劳评价方法，其主要是通过对小鼠进行露酒灌胃处理后，进行小鼠体重及其体内血尿素氮和血乳酸含量测定实验、重游泳试验、常压抗缺氧试验以及肝糖原含量测定实验[33]，达到有效判定该植物露酒的抗疲劳能力的目的。

3.5 护肝功能

植物露酒主要成分是乙醇，其进入人体后，不到10%直接由肺、汗水、肾排出，剩余体内乙醇首先在肝脏中被氧化成乙醛，乙醛又在乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)的作用下生成乙酸，以此达到解酒目的，但是在解酒的同时，乙醇的中间产物乙醛也会对肝脏细胞产生毒害作用。而露酒中的黄酮类化合物能够减轻乙醛对肝脏的损伤，进而达到保护肝脏的作用[34]。

在肝脏氧化代谢中主要起作用的是乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)、ALDH 途径，其中ALDH酶是乙醛转化成乙酸过程中的限制酶，该酶活性降低将影响乙醛转化成乙酸的速率，使乙醛在肝脏细胞中大量累积，给肝脏带来不可逆的迫害[34]。而植物露酒中的黄酮类物质能够清除ALDH酶在醛氧化过程中产生的自由基和活性氧，增强ALDH酶的活性，进而加快了植物露酒中乙醇的氧化代谢。植物露酒不仅满足了人们对酒精刺激感的追求，也达到了保护肝脏的效果，使植物露酒中黄酮类物质已经成为酒类研究中的一个热点。大量黄酮类物质存在于苦荞植物中，苦荞植物露酒的浸提制备工艺能将大量黄酮物质带入酒中，使该酒具有解酒护肝的作用[35]。

基于醉酒表现的研究，通过对小鼠灌胃试验(模拟人体醉酒的行为)，测定小鼠醉酒率、醉酒耐受时间、醉睡时间，以及血清指标测定(谷草转氨酶)和肝脏指标测定(丙二醛、超氧化物歧化酶)，明确植物露酒的护肝能力[35]。

3.6 降脂功效

植物露酒中黄酮类化合物可通过抑制与脂肪合成有关酶类(脂肪酸合酶)的活性，促进体内脂肪代谢，从而达到降脂目的。WU等[36]研究发现，富含黄酮类化合物的乙醇提取物可抑制脂肪酸合酶的活性，减少体内脂质物质的积累，达到降脂作用。其次，植物露酒中的槲皮素提取物在该方面具有同种功能。另外，ABDULLAHI等[37]发现黄酮类化合物刺激了某种肌肉细胞中的解偶联蛋白，促进能量以非颤抖性产热的方式被消耗，降低脂肪堆积。其次，植物露酒可阻碍机体脂肪的有效吸收，桑葚果中存在两种新型的异黄酮，对胰脂肪酶有很强的抑制作用，削弱对摄入脂肪的分解力，减少肠道对脂肪分解产物的吸收，达到治疗和预防过度肥胖的目的[38]，为桑葚类果露酒的市场化开发提供理论支撑。LIU等[39]发现原花青素除了阻碍脂肪吸收外，还具有调节肠道菌群的构成和活性的作用，并推测黄酮类化合物的降脂功能，并非某一黄酮类物质的单一作用，而是多种黄酮类化合物间的共同效应。荷叶露酒中含有槲皮素-3-丙酯和山奈酚等多种黄酮类化合物，能够充分解释荷叶露酒具有降脂等保健功能[11]。

冯丹[11]以荷叶营养保健酒为研究对象，拟用一定剂量的该露酒酒样连续灌胃高血脂大鼠，通过测定小鼠的体重及血清中总胆固醇、总甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇等水平，评价该酒的降脂功效。

4 植物露酒中黄酮类化合物检测分析技术

4.1 植物露酒总黄酮比色法分析技术

用于植物露酒总黄酮类化合物含量测定的分光光度计法，主要有硝酸铝比色法、三氯化铝-醋酸钾比色法和直接紫外测定法(表4)。硝酸铝比色法是2010年《中国药典》颁布的方法，以芦丁为对照品，与显色剂形成红色络合物于波长500 nm处进行比色分析测定其含量；三氯化铝-醋酸钾比色法是根据上述方法改进而得；除上述两种方法外，在《保健食品检验与评价技术规范》中采用的方法是直接紫外测定法，即样品用聚酰胺粉吸附后，先用甲苯洗脱，再用甲醇洗脱黄酮类物质，于360 nm处测定其吸收值。

目前硝酸铝比色法、三氯化铝-醋酸钾比色法是常用的分光光度计法，而直接紫外法需使用甲苯和甲醇等高毒试剂，且试剂用量较多，该方法使用较少[40]。

表4 植物露酒中总黄酮分析方法Table 4 Analysis method of total flavonoids in plant liqueur

4.2 植物露酒单体黄酮色谱法分析技术

色谱法是目前在单体黄酮检测中最实用的分析方法之一，用于植物露酒黄酮类化合物的主要检测方法有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、高效液相色谱法-串联质谱法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)、超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS)；超临界流体色谱法(supercritical fluid chromatography，SFC)(表5)。目前，HPLC是分析露酒中黄酮类化合物种类及含量最常用的色谱法，除具有测量范围广、灵敏度高、分离效果好等优点外，后期维护费用也相对较低，常用于科研工作者批量数据检测，在减少了工作量的同时规避了人为因素造成的实验误差。

UPLC-MS多用于新型植物露酒中未知成分的定性定量分析，对开发植物露酒新品种有着重要意义。

表5 植物露酒单体黄酮色谱分析方法Table 5 Chromatographic analysis methods of flavonoids in plant liqueur

4.2.1 样品前处理

由于植物露酒含有18%～45%的乙醇，黄酮类化合物又是醇溶性物质，因此通过对固相萃取净化、QuEChERS 净化(快速样品前处理技术)以及直接稀释进样法进行回收试验，黄酮类化合物回收率均在76.4%～103.5%，表明萃取等前处理手段的效果不大[42]。此外，超临界二氧化碳萃取(supercritical fluid extraction，SFE)也不能提高黄酮类化合物的回收率[42]，目前，在植物露酒黄酮类化合物测定时可选择直接稀释进样法。

4.2.2 液相色谱柱

承担分离作用的色谱柱是液相系统的关键组成部分之一，使多组分样品通过色谱柱分离为单一组分，从而进入检测器进行定性或定量分析，分离效果直接关系到后续测定结果的准确性。液相色谱柱主要分为硅胶填充柱、聚合物填充柱和无机填充柱。用于酒类多组分检测多为硅胶填充柱，可分为反相色谱柱、正相色谱柱和离子交换色谱柱。由于植物露酒黄酮类化合物组分复杂，为了进行有效组分分析，应选择较长的反相色谱柱，例如Waters C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Luna C8(2)100A(150 mm×2 mm，3 μm)等，这类长柱虽然运行时间长，但针对植物露酒中结构类似物居多的黄酮类化合物具有较高分辨率。此外，植物露酒含有色素、多糖类、氨基酸类等干扰物质，一方面需采用对应的阴性露酒来配制基质曲线，以标准曲线和基质曲线的斜率之比考察基质效应的影响，另一方面进样前需用0.22 μm有机滤膜过滤，防止色谱柱堵塞。

4.2.3 检测器

黄酮类化合物由于其特殊结构，主要有两个紫外吸收峰(Ⅰ型吸收峰在300～400 nm，Ⅱ型吸收峰在250～280 nm)，目前用于植物露酒黄酮类化合物测定所用检测器主要有紫外吸收检测器和二极管阵列检测器，前者线性范围广、对温度和流速不敏感，所测物质必须要有紫外吸收；后者是光学多通道检测器，测定结果是光谱(定性)和色谱(定量)结合的三维图谱，目前，广泛用于植物露酒黄酮类化合物多组分定性定量分析[42]。

5 展望

植物露酒中黄酮类化合物的功能性研究和分析检测技术已经取得了一定进展，抗氧化、抗癌、抗菌、抗疲劳、护肝等功能活性评价方法相对成熟，紫外分光光度法和色谱法在新型植物露酒黄酮类化合物含量测定中也得到广泛应用，但随着植物露酒行业的快速发展，酒中黄酮类化合物的其他功能特性和检测技术手段将会被挖掘，仍有许多方面需要进行深入剖析和探究：

(1)黄酮类化合物的功能活性除本文阐述的几种之外，还具有调节免疫力、抗过敏、抗病毒等活性，但目前在植物露酒中研究较少，也正是因为植物露酒产品功能性研究不充分，导致竞争力薄弱。因此，通过细胞试验、动物试验或临床试验对黄酮类化合物其他功能活性进行深入研究，对丰富植物露酒功能性具有重要意义。

(2)植物露酒相关研究主要集中在新品种露酒的开发，而露酒中黄酮类化合物等有效成分的稳定性探究相对较少，为提高植物露酒品质和利于露酒产品市场化，应加大对主要功能性因子稳定性的研究。

(3)目前，植物露酒中黄酮类化合物的检测分析主要基于紫外分光光度计和液相色谱。但这两种检测手段只能用于露酒中黄酮类化合物阶段性检测，不能实时快速分析黄酮类化合物，更多用于实验室检测。可以考虑将其他检测方法(如红外光光谱法)应用于植物露酒黄酮类化合物分析中，以期实现植物露酒中黄酮化合物的实时检测。