酸奶发酵剂中菌株分离重组及其在豆乳中的发酵特性

任海东，李兴飞，成吕睿，鲁绪强，刘军，时玉强，华欲飞*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)2(禹王植物蛋白有限公司，山东 德州，251500) 3(上海协和双语高级中学，上海，201103)

大豆是一种优质的植物蛋白来源，具有很高的蛋白质含量，且氨基酸评分较高，和牛奶蛋白接近。研究显示，在每天的蛋白质摄入中若包含50%的植物性蛋白质将有助于减少食品系统对环境的影响，同时满足全球蛋白质需求，并且这样的饮食结构会更加均衡和健康[1-2]，因此豆浆也被视作牛奶的替代品。豆浆经过乳酸菌发酵后，不仅保留了原有的品质，还可以降低异味成分和抗营养因子，产生“令人愉悦”的风味[3-4]，同时促进葡萄糖苷元异黄酮转化为苷元异黄酮，提高异黄酮生物效价[5-6]，因此发酵豆乳具有很好的开发前景。

现有的直投式发酵剂多是用于发酵牛奶，针对特定植物基酸奶发酵的较少，然而乳酸菌是影响发酵豆乳品质的重要因素，不同乳酸菌的生长和产酸活性、蛋白水解活性以及所产生的质构和风味特性有很大差异[7-11]。研究显示，在常规酸奶发酵剂YC381中加入1株乳双歧杆菌CCDM94后再进行豆浆发酵，最终产品中的各乳酸菌数量、乙醛以及异黄酮的含量均有所提升[12]。而POUDEL等[13]则通过实验确定了在豆乳中进行发酵的最优菌种组合为嗜热链球菌和副干酪乳杆菌。本文从现有的直投式发酵剂中分离出多种乳酸菌，分别研究它们在豆浆体系中进行单菌、混合菌发酵时的发酵特性，以及产品品质，以期进一步认识不同乳酸菌在豆浆中的发酵行为，为开发适合于豆浆发酵的菌种组合提供指导和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

直投式发酵剂A、B、C、D、E、F、G和H，表面有光泽、无霉变、颗粒饱满的精选大豆，蔗糖、葡萄糖、柠檬酸钠、K2HPO4，市售；采用无氧磨浆工艺制备的豆浆。

1.1.2 试剂

MRS固体培养基、MRS液体培养基、M17固体培养基、M17液体培养基，杭州百思生物技术有限公司；冰乙酸、三氯乙酸、β-巯基乙醇、邻苯二甲醛、邻苯二甲酸氢钾、十二烷基硫酸钠、四硼酸钠、甲醇、NaOH、L-亮氨酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2-甲基-3-庚酮标准物，西格玛-奥德里齐公司。

1.2 仪器与设备

UV-2100紫外可见分光光度计，尤尼科上海有限公司；AB204-N型分析天平、PHS-3TC pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；2.5 L圆底立式厌氧培养袋，百思一基生物耗材店；高速离心机M16，湘仪离心机仪器有限公司；血球计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公司；HH-S数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗器械厂；SCIONSQ-456-GC气质联用仪，美国布鲁克-道尔顿公司；FA25高速剪切乳化机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；TA.XTPlus型质构仪，英国SMS公司；萃取头(DVB/CA/PDMS-50/30 μm)，美国Supelco公司；实验室自制磨浆系统。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的筛选

从直投式酸奶发酵剂中分离鉴定的26株乳酸菌中筛选出适合在豆浆体系中发酵的乳酸菌种。首先采用血球计数板进行乳酸菌计数，分别接种3×106CFU/g，发酵6 h，以发酵终点的pH、酸度为指标，从多种嗜热链球菌中筛选出产酸较快的菌株。再将其他乳杆菌以及双歧杆菌和嗜热链球菌分别进行混合发酵，筛选出合适的乳酸菌。

1.3.2 乳酸菌的复配

经研究发现，嗜热链球菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌具有较好的发酵性能，其中保加利亚乳杆菌具有较强的蛋白水解活性，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌具有良好的风味物质形成能力，副干酪乳杆菌和发酵乳杆菌产黏特性较好。故以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为基础菌种，同时添加不同的产黏菌和产香菌进行多种菌的混合发酵实验，并且和现有的直投式发酵剂作对比。

1.3.3 发酵豆乳工艺

豆浆→60 ℃预热→调制→杀菌(95 ℃，5 min)→冷却至42 ℃→接种→发酵至终点pH 4.5→冷藏→后熟→待用。

1.3.4 发酵性能测定

1.3.4.1 pH值的测定

用 PHS-3TC型高精密度pH计测定。

1.3.4.2 酸度的测定

根据国家标准GB 5009.239—2016中的第二法pH计法，取10 g样品加入10 g煮沸后冷却的水，再用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.30，记录消耗的NaOH标准溶液的体积。酸度/°T=消耗的NaOH 溶液体积(mL)×10。

1.3.4.3 游离氨基含量的测定

采用邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)法[14]。取3 g左右的豆浆样品，定容至10 mL，然后取3 mL，加入5 mL 0.75 mol/L三氯乙酸溶液，混匀后静置10 min，过滤，取滤液200 μL加入4 mL OPA试剂，室温反应2 min后测定340 nm处吸光度。OPA试剂组成为：25 mL 10 mmol/L四硼酸钠溶液，2.5 mL 20%十二烷基硫酸钠，40 mg OPA(用1 mL甲醇溶解)和100 μL β-巯基乙醇。标曲制作采用的是梯度稀释的L-亮氨酸溶液(0～2 mmol/L)。

1.3.4.4 活菌数的测定

参照谭允冰[15]的方法。用9 g/L的NaCl溶液梯度稀释样品，M17琼脂培养基进行球菌活菌数计数，冰醋酸酸化的MRS琼脂培养基(pH 5.4)进行杆菌活菌数计数，数据表示为CFU/g。

1.3.4.5 质构测定

1.3.4.6 风味成分分析

GC-MS条件：采用DB-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min；以6 ℃/min升温至100 ℃；再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持7 min；不分流进样。

质谱条件：离子源EI源，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，电子能量70 eV，扫描范围m/z33～350，采集方式为Scan。

样品预处理方法：准确称取15 g酸奶，加入少许16 g/L的NaCl溶液，转移至容量瓶，定容至100 mL，并向其中加入20 μL的内标物(2-甲基-3-庚酮)，其质量浓度为32 μg/mL，摇匀，然后进行微剪切，再用移液管移取5 mL放置于萃取瓶中，放置在已经设定好温度的60 ℃水浴锅中。将老化的固相微萃取针插入样品瓶，边搅拌边顶空吸附30 min。

1.4 数据分析

酸奶质构特性测试完成后，软件Texture Expert Exceed可自动对数据进行存储分析生成表格进行统计。采用Origin 9.1软件得到乳酸菌在发酵豆浆过程中的pH和酸度随时间的变化趋势图。并用SPSS 17.0对结果的显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的筛选

嗜热链球菌是酸奶发酵的常见菌种，其优良的产酸性能使其成为酸奶发酵的常用菌种。从表1可知，分离的9株嗜热链球菌中，CG45-1产酸能力最强，发酵6 h后豆浆的pH、酸度和其他嗜热链球菌相比存在显著差异(P<0.05)。而对于蛋白水解活性而言，由于起始豆浆中L-亮氨酸含量为0.779 mg/g，故对所有的嗜热链球菌而言，在发酵6 h后其蛋白水解度均低于起始值，说明嗜热链球菌在豆浆中生长，其蛋白水解能力要低于其对小肽和氨基酸的消耗能力。

表1 不同嗜热链球菌的发酵性能Table 1 Fermentation performance of different S.thermophilus strains

以CG45-1为基础菌种，分别和5株保加利亚乳杆菌、3株嗜酸乳杆菌和2株副干酪乳杆菌进行混合菌发酵，依据pH和酸度变化分别从同一属的乳杆菌中挑选出产酸较快的乳酸菌。从图1和图2可知，保加利亚乳杆菌CG45-2、CG90-2和CG45-1组合发酵时发酵速率增加，达到pH 4.5的时间比嗜热链球菌单菌发酵缩短1 h，而另外3株保加利亚乳杆菌对于嗜热链球菌的发酵速率并无影响。图3和图4表明，3株嗜酸乳杆菌CGSS、CG27-3和CG3K-3中，CG3K-3与CG45-1的组合发酵速率最快，而2株副干酪乳杆菌CG3K-2和CG31与CG45-1组合发酵速率较为一致，较优于CG45-1单菌发酵，同时在终点处的酸度比单菌发酵高出7～10°T。

图1 嗜热链球菌与不同保加利亚乳杆菌组合 发酵时的pH变化Fig.1 Changes in pH of S.thermophilus and different L.bulgaricus strains during fermentation

图2 嗜热链球菌与不同保加利亚乳杆菌组合 发酵时的酸度变化Fig.2 Changes in acidity of S.thermophilus and different L.bulgaricus strains during fermentation

图3 嗜热链球菌与不同嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌 组合发酵时的pH变化Fig.3 Changes in pH of S.thermophilus and different L.acidophilus and L.paracasei strains during fermentation

图4 嗜热链球菌与不同嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌 组合发酵时的酸度变化Fig.4 Changes in acidity of S.thermophilus and different L.acidophilus and L.paracasei strains during fermentation

2.1.1 风味成分

经过初步筛选后，分别选择CG90-2、CG45-2、CG3K-3以及CG3K-2和CG31做进一步的筛选，同时和其他乳杆菌包括鼠李糖乳杆菌CGS、发酵乳杆菌CGF、瑞氏乳杆菌CG3K-4、植物乳杆菌CG47-2、乳双歧杆菌CGR、长双歧杆菌CGC作对比，菌种组合列举在表2中。表3给出了CG45-1和其他乳杆菌分别进行混合菌发酵时，发酵豆乳中的风味物质种类及含量。

1.由原来的全过程审批转向只对关键环节审批。此前，各级监管部门对政府采购各环节采用审批制管理，从采购计划到招标公告、招标文件、变更公告、中标(成交)公告、变更采购方式等每个环节都要审批。目前，除个别环节外，基本上采用备案制管理，将权力和责任交给了采购人和采购代理机构。

表2 菌种组合列表Table 2 List of strains combination

表3 以不同乳酸菌组合制备的发酵豆乳的风味成分 单位：mg/kg

酸奶的风味主要是由体系中的挥发性酸、非挥发性酸、羰基化合物、低级醇等构成，其中以羰基化合物为主[16-18]，由表3可以看出，嗜热链球菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵时酮类风味物质2，3-丁二酮含量最高，其次是植物乳杆菌和另外2株副干酪乳杆菌，并且与植物乳杆菌混合发酵时3-羟基-2-丁酮含量最高。另外发酵豆乳的风味还受到豆浆本身所存在的一些风味成分的影响，特别是己醛，它是最具有典型豆腥味的风味成分，而且阈值低[19]，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵终点的己醛含量均很低。因此从挥发性风味成分分析，鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌是较为突出的豆乳发酵乳酸菌。

2.1.2 游离氨基含量

由表4可见，所有的菌种组合中，CG45-1和CG90-2的组合发酵终点游离氨基含量最高，与其他菌种组合之间存在显著差异(P<0.05)。其余的组合在发酵终点时的游离氨基含量均较低，说明了多数乳杆菌对于大豆蛋白的水解利用有限。

表4不同乳酸菌组合制备的发酵豆乳中的游离氨基含量 单位：mg/g(以亮氨酸计)

2.1.3 质构特性

不同乳酸菌组合发酵的产品质构参数如表5所示。CGF、CG3K-2在和CG45-1组合发酵豆浆时，产品的质构特性较好。但是与牛奶发酵相比，质构参数值较低，刘文文等[20]研究不同菌种组合发酵时，酸奶硬度值范围是110～141 g。这可能和牛奶中脂肪含量较高有关。解冰心[21]的研究发现，添加3.5%不同植物油时，酸奶的硬度值是187～273 g。

表5不同乳酸菌组合制备的发酵豆乳的质构参数Table 5 Texture parameters of fermented soy milk prepared by combinations of different lactic acid bacteria

2.1.4 乳酸菌活菌数

发酵终点乳酸菌活菌数如图5所示。和不同乳酸菌组合发酵时CG45-1的生长情况不同，在和CG3K-2和CGS组合发酵时生长较好，与其他组合之间存在显著性差异(P<0.05)，发酵终点的活菌数均高于2.9×108CFU/g。而对于乳杆菌及双歧杆菌而言，在发酵终点时的活菌数均低于嗜热链球菌，其中CGS生长较快，活菌数达2.82×108CFU/g，其次是CG90-2和CG3K-2，与其他乳杆菌活菌数均存在显著性差异(P<0.05)。

图5 不同菌种组合发酵终点时的乳酸菌数Fig.5 The number of lactic acid bacteria at the end of fermentation by different strain combinations

HATI等[22]的研究发现，嗜热链球菌发酵豆浆6 h后，活菌数约为3×108CFU/g，而鼠李糖乳杆菌约为2.0×107CFU/g。

2.2 发酵豆乳品质对比

优选菌种组合12(CG45-1+CG90-2+CGS+CG47-2+CGF+CG3K-2)和8种直投式发酵剂的发酵产品特性比较结果如表6和表7。组合12混合发酵产品的酸度和游离氨基含量显著高于8种直投式发酵(P<0.05)。对于乳酸菌数而言，组合12混合发酵和直投式发酵剂E无显著性差异，均显著高于其他直投式发酵剂。但在硬度方面，组合12混合发酵的产品不如直投式发酵剂B、C、D、E、F和H与A、G无显著性差异(P<0.05)，这可能和蛋白水解情况有关，如于茜[23]研究发现大豆蛋白经碱性蛋白酶水解过后，发酵豆乳的稠度系数明显下降。杨媚[24]的实验结果也相似，通过大豆萌发，使得大豆球蛋白逐渐被降解，随着发芽时间的延长，硬度和黏附性均不断下降。从风味成分分析来看，主要风味物质均为2，3-丁二酮，组合12制备的发酵豆乳中其含量比发酵剂B低，而高于其他7种发酵剂，同时异味成分己醛比8种直投式发酵剂制备的发酵豆乳低。

表6 自选菌种混合发酵和直投式发酵剂发酵特性比较Table 6 Comparison of fermentation characteristics between optimized strains and direct vat set starters

表7 优选菌种和直投式发酵剂制备的发酵豆乳中挥发性风味成分 单位：mg/kg

3 结论与讨论

为开发适合豆浆体系发酵的乳酸菌种，以pH、酸度、风味成分、质构特性和活菌数为评价指标，从26株直投式发酵剂中分离鉴定的乳酸菌中筛选出6株具有较强发酵性能、食用安全的菌种，包括嗜热链球菌CG45-1、保加利亚乳杆菌CG90-2、副干酪乳杆菌CG3K-2发酵乳杆菌CGF、鼠李糖乳杆菌CGS和植物乳杆菌CG47-2。这些菌分别具有较强的产酸速率、较高的蛋白水解活性、优良的质构特性以及较好的风味物质形成能力，可以利用这些菌种来开发适合豆浆体系发酵的直投式发酵剂。

发酵豆乳中风味成分主要为2，3-丁二酮，乙醛含量很低，需要进一步研究发酵豆乳中的风味物质形成机制，以便更好地调控这2种主要风味物质的含量及比例。同时本文是在固定配方的条件下进行不同乳酸菌在豆浆中的发酵特性研究并挑选合适的乳酸菌，其他不适合在豆浆中生长的乳酸菌可能需要通过发酵配方的研究来改变它们在豆浆中的发酵特性，从而改善产品的发酵性能。