硼酸对霞多丽葡萄叶片抗氧化酶类的影响

杨述睿

（甘肃民勤连古城国家级自然保护区管护中心，甘肃 民勤 733300）

霞多丽是一个古老的优良白葡萄酒品种，果实品质好，栽培经济效益显著，发展前景十分广阔。随着生活水平的提高，人们对霞多丽葡萄果品的安全性和营养性有了更高的要求［1］。

硼是植物生长发育过程中必需的微量元素，对维持细胞生命活动及稳定细胞壁结构具有重要作用。硼还会影响植物细胞内一些物质的活性，从而影响细胞膜的透性及细胞内其他物质的代谢［2］。据报道，在缺硼条件下，甘蓝型油菜叶片中的过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性呈下降趋势，而过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性呈上升趋势［3-4］；硼酸能提高红掌叶片中SOD、POD活性，且二者的变化规律相似［5］。而对于早期缺硼的葡萄，其新梢顶端的幼叶会出现扩散的黄色或失绿斑点，随后斑点连成一片，最后变成褐色枯死；严重时，其花冠不能正常开裂，后变成赤褐色，最终脱落；其花粉的发芽率显著低于健康植株，还会影响受精，引起落花；落花后大约7 d，其子房多数脱落，坐果率较低［6］。葡萄花而不实，口感变差，产量降低，这些均为缺硼所致［7］。

与此同时，过量的活性氧可引起植物细胞程序性死亡，严重时会使植物衰老和死亡。提高SOD、POD、CAT活性，能使细胞内的活性酶维持在一个较低水平，保护植物体免受自由基伤害。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验选用四年生霞多丽酿酒葡萄，种植株行距为0.7 m×2.0 m。试验试剂选用硼酸、氮蓝四唑、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠、Triton X-100核黄素、双氧水、石英砂、L-甲硫氨酸、抗坏血酸及聚乙烯吡咯烷酮。

1.2 试验方法

1.2.1 硼酸喷施方法。分别设置0‰（CK）、1‰、2‰、3‰和4‰5个浓度的硼酸水溶液处理，间隔15 d，重复进行4次施肥处理。每次将不同浓度的硼酸溶液分别均匀喷至试验组叶片的正反两面，以叶面出现水珠但不滴流为止。每个处理重复3次，3株为1个小区，共45株，挂牌采样。

1.2.2 采样方法。采样时间为葡萄坐果期、转色期及成熟期。每次采集时，选择葡萄植株距地面高0.8～1.2 m的叶片，尽量保证所采叶片的颜色与叶面积一致。将采摘好的叶片放置于冰盒中冷藏，并用蒸馏水洗涤3次，之后用滤纸擦干叶面水分，完全晾干后用小剪刀快速剪碎，混匀、称量、分样包装，放置于液氮中保存备用。

1.3 指标测定方法

1.3.1 粗酶液提取。取处理好的样品0.5 g，加提取液2 mL及适量石英砂于研钵中研磨，用提取液定容至10 mL刻度试管中，冰浴10 min，期间多次摇晃，使提取液与样品充分接触。将冰浴后的粗酶液装入离心管中，以12 000 r/min的转速在4℃温度条件下离心20 min，取上清液置于4℃环境保存备用。

1.3.2 CAT活性测定。在比色皿中加入制备好的粗酶液0.2 mL、0.033 5 mol/L的双氧水2.8 mL，测定2 min内OD240吸光度值，以蒸馏水作为对照［8］。CAT活性计算方法见公式（1）：

式（1）中，ΔA240表示反应混合液的吸光度变化值（A始－A终，A始表示光下对照管吸光度，A终表示样品测定管吸光度），Vt表示测定时酶液的体积（0.2 mL），Vs表示酶提取液总体积（10.0 mL），t表示加双氧水开始到最后一次读数的时间（min），FW表示样品鲜质量（g）。

1.3.3 POD活性测定。按顺序向比色皿中分别加入粗酶液0.2 mL、0.3%愈创木酚2.6 mL、0.6%H2O20.2 mL，构成总体积为3 mL的反应体系，用蒸馏水调零。加入H2O2后立即开始计时，测定2 min内OD470吸光度值。POD活性计算方法见公式（2）：

式（2）中，OD470F表示反应混合液吸光度终止值，OD470I表示反应混合液吸光度初始值，V1表示样品提取液总体积（mL），FW表示样品鲜质量（g），t表示试样反应时间（min），V2表示测定用粗酶液量（mL）。

1.3.3.4 SOD活性测定。在遮光条件下，向试管中依次加入0.05 mol/L pH值为7.8的PBS溶液1.5 mL、130 mmol Met溶液0.3 mL、750μmol/L NBT溶液0.3 mL、100μmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液0.3 mL、蒸馏水0.5 mL。向1号管加入粗酶液0.1 mL，2、3号管分别加入等量蒸馏水，再加入20μmol/L核黄素0.3 mL。加液完成后立即将3号管置于黑暗环境下，1、2号管置于3 000～4 000 lx、25℃光照环境下，待2号管变色后立即遮光，3号管液体做对照，测定SOD在OD560下的吸光度值。SOD活性计算方法见公式（3）：

式（3）中，A0表示光下对照管吸光度值，AS表示样品测定吸光度值，Vt表示样品提取液总体积（mL），FW表示样品鲜质量（g），Vs表示测定用粗酶液量（mL），t表示显色反应光照时间（min）。

2 结果与分析

随着硼酸溶液浓度的增加，霞多丽葡萄叶片的SOD活性表现出先上升后下降的趋势，硼酸水溶液处理后的叶片SOD活性均高于CK，分别高出1.11、1.17、1.22、1.18倍，其中3‰硼酸处理与CK的SOD活性存在显著性差异（P＜0.05），其值为20 793.87 U/（gFW·h）（见图1）。

图1 不同浓度硼酸对霞多丽叶片SOD活性的影响

随着硼酸溶液浓度的增加，霞多丽葡萄叶片POD活性呈先上升后下降的趋势，硼酸水溶液处理后的叶片POD活性均高于CK，分别高出1.02、1.04、1.05、1.04倍，其中3‰硼酸处理与CK的POD活性存在显著性差异（P＜0.05），其值为348.82μg/（gFW·min）（见图2）。

图2 不同浓度硼酸对霞多丽叶片POD活性的影响

随着硼酸溶液浓度的增加，霞多丽葡萄叶片CAT活性呈先上升后下降的趋势，硼酸水溶液处理后的叶片CAT活性均高于CK，分别高出1.37、1.34、1.83、1.35倍，其中3‰硼酸处理与CK的CAT活性存在显著性差异（P＜0.05），其值为729.13 U/（gFW·min）（见图3）。

图3 不同浓度硼酸对霞多丽叶片CAT活性的影响

3 结论

与对照（CK）相比，硼酸水溶液处理对霞多丽葡萄叶片的SOD、POD、CAT活性及细胞膜完整率均有提升作用，具体表现为3‰硼酸溶液处理霞多丽葡萄叶片的SOD、POD、CAT活性较CK分别提升了1.22、1.05、1.83倍，且均存在显著性差异（P＜0.05）。

过量的活性氧能引起植物细胞程序性死亡，严重时会使植物衰老和死亡；低浓度的活性氧能作为信号分子，诱导防御基因的表达和植物对环境的适应反应，调控不同的代谢反应［9-10］。SOD活性具有控制膜质过氧化水平、保护酶系统的作用，能抑制自由基对细胞产生的危害。POD是植物体内自由基清除酶之一，能使植物体内活性氧维持在较低水平，保护细胞免受伤害［11］。提高SOD、POD、CAT活性，可使细胞内的活性酶维持在一个较低水平，保护植物体免受自由基伤害［12-13］。该文通过选取上述3种酶为考察指标，间接分析硼对酿酒葡萄霞多丽树体寿命的影响，结果表明，一定浓度的硼肥能有效提高酿酒葡萄霞多丽树体的抗氧化能力，并延长酿酒葡萄霞多丽树体的寿命。