布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶(PGK)的毒性作用研究

李志强，王书利，李欣欣，张倪晨，席丽，崔艳艳

(商丘师范学院 生物与食品学院，河南 商丘 476000)

布鲁氏菌(Brucella)为革兰氏阴性菌，是人和动物机体细胞内的兼性病原体，能够在专业和非专业的吞噬细胞内繁殖[1]，引起人和多种动物发生疾病，给人类带来巨大经济损失[2].布鲁氏菌可在动物体内引起急性传染病和妊娠动物的流产[3].人布鲁氏菌病的症状是发烧、关节炎、感染性心内膜炎、脾脓肿、败血症和脊椎炎[4,5].在宿主体内，为了促进细菌繁殖，布鲁氏菌必须适应恶劣的胞内环境胁迫，或影响某些信号途径和蛋白的表达.已经证实布鲁氏菌中存在多种应激相关蛋白和毒力相关蛋白，但其潜在致病机制尚不清楚.

已有研究表明pgk基因编码磷酸甘油酸激酶.PGK将磷酸基从1,3-二磷酸甘油酯转移到ADP，形成ATP和3-磷酸甘油酯，是糖酵解和糖异生生成ATP的重要步骤[6].因此，PGK是布鲁氏菌非常重要的激酶.已有研究表明，布鲁氏菌pgk突变体在骨髓源巨噬细胞和小鼠体内的毒力是减弱的[7].所以，PGK与布鲁氏菌的毒力有关.本研究评价了2308Δpgk突变株在环境压力下的生存能力，以及对巨噬细胞的毒性作用，目的是进一步揭示布鲁氏菌中PGK的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培养基和细胞系

布鲁氏菌S2308亲本株和2308Δpgk突变株为本研究室保存；布鲁氏菌液体培养基(TSB)和布鲁氏菌固体培养基(TSA)购自美国BD公司；琼脂粉购自日本Biosharp公司；氯化钠购自上海生工生物工程股份有限公司；CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒购自美国Promega公司；小鼠巨噬细胞系(RAW 264.7)购自北京协和细胞资源中心.

1.1.2 主要试剂

多粘菌素B和脱氧胆酸钠购自德国Sigma公司；庆大霉素购自美国Invitrogen公司；DMEM高糖、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司.

1.2 方法

1.2.1 体外环境压力实验

将S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C接种于10 mL TSB培养基中，在37 ℃条件下培养至对数生长早期(OD600=0.6).然后将细菌培养至指数生长期，接种于1.5 M NaCl和3.0 M NaCl中，刺激30 min.另外，在37 ℃培养条件下，将细菌在pH为2、4、6、8、10、12的TSB培养基中刺激5 min.或者将指数生长期的细菌转移至预热40 ℃、50 ℃或60 ℃的TSB培养基中，在40 ℃、50 ℃或60 ℃下孵育1 h.刺激后将各组细菌离心后，10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布TSA平板，对细菌进行CFU计数，以在正常TSB培养基中生存的细菌为对照(存活率100%)，计算各组细菌的存活率.实验重复3次，每次3个平行.

1.2.2 多粘菌素B敏感性实验

按照文献报道的方法测定S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C对多粘菌素B[8]和脱氧胆酸钠的敏感性.离心培养至对数生长中期(OD600=1.0)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C，用PBS缓冲液，制备成约1 × 104CFU/mL的细菌悬液.将100 μL细菌悬液与100 μL不同浓度的多粘菌素B(终浓度分别为0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL)或脱氧胆酸钠(终浓度分别为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.4 mg/mL)混合后培养于96孔板中.在37 ℃、5% CO2环境中培养1 h，取50 μL进行10倍梯度稀释后，选择合适的稀释度涂布TSA平板，对细菌进行CFU计数.以未加多粘菌素B和脱氧胆酸钠的细菌为对照(存活率100%)，用存活菌的CFU除以接种菌的CFU，计算存活率.实验重复3次，每次3个平行.

1.2.3 巨噬细胞毒性实验

按照文献报道的方法，分别用50∶1、100∶1和1000∶1感染复数(MOI)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C感染小鼠巨噬细胞RAW 264.7，用CytoTox 96非放射性细胞性法测定LDH水平[11].将小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养至6孔板内，细胞在37 ℃、5% CO2的环境中培养至单层(约1 × 105个/孔)，分别用50∶1、100∶1和1000∶1感染复数(MOI)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C感染细胞.感染后的细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱内，感染45 min后，细胞用不含抗生素的DMEM培养液漂洗两次，随后加入含50 μg/mL庆大霉素的DMEM，孵育1 h，杀死胞外菌.1 h后弃去培养液，加入新鲜的含25 μg/mL庆大霉素的DMEM培养液(此时定义为0 h).在感染后12 h、24 h和48 h，按照试剂盒说明书测定LDH水平.实验重复3次，每次3个平行.

1.2.4 统计分析

细菌对多粘菌素B、脱氧胆酸钠的敏感性和巨噬细胞的细胞毒性以平均值±SD表示.用SPSS 17.0分析突变株与亲本株之间的差异性，当P值< 0.05时，差异显著；P值< 0.01时，差异极显著.

2 结果与分析

2.1 PGK对应激条件下布鲁氏菌存活的影响

布鲁氏菌可以在宿主细胞中生存，必须适应细胞内环境.为了确定pgk突变是否影响布鲁氏菌对细胞内环境的适应，比较了S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C菌株在模拟细胞内环境的各种应激条件下的存活率.这些胁迫环境包括高盐环境(1.5 M和3.0 M NaCl)、酸碱环境(pH 2、4、6、8、10或12)和热休克环境(40 ℃、50 ℃或60 ℃).在不同的应激条件下，2308Δpgk的存活率明显低于S2308和2308Δpgk-C(P< 0.05)(图1).在3.0M NaCl刺激条件下，各菌株的存活率明显低于1.5M NaCl刺激条件下的存活率(图1A).在pH 2、4、8、10、12刺激条件下，各菌株的存活率均低于pH 6刺激条件下的存活率(图1B).在不同温度下热休克处理后，各菌株的存活率随温度的升高而降低(图1C).结果表明，pgk的缺失改变了布鲁氏菌对环境的适应性，PGK对布鲁氏菌适应应激环境具有重要意义.

图1 布鲁氏菌对体外应激的敏感性Figure 1 Sensitivity of Brucella to in vitro stressesNote:Brucella strains were grown in TSB to the early logarithm phase,then treated with (A) high salt,(B) different pH and (C) heat shock.After the treatment,the survival percentage of the bacteria was determined.Significant differences between 2308Δpgk mutant and S2308 parental strain are indicated by * (P < 0.05),** (P < 0.01).

2.2 PGK对多粘菌素B和脱氧胆酸钠的敏感性

为了评定2308Δpgk突变体对多粘菌素B和脱氧胆酸钠的敏感性，我们测定了2308Δpgk突变体在多粘菌素B和脱氧胆酸钠处理下的存活情况.结果表明，与S2308和2308Δpgk-C相比，多粘菌素B和脱氧胆酸钠处理后，2308Δpgk的存活率显著降低(P< 0.05)(图2).此外，2308Δpgk突变体随着多粘菌素B和脱氧胆酸钠浓度的降低而敏感性增加(图2).结果表明，PGK的失活导致布鲁氏菌对多粘菌素B和脱氧胆酸钠的敏感性增加.

图2 布鲁氏菌对多粘菌素B和脱氧胆酸钠的敏感性Figure 2 Sensitivity of Brucella to polymyxin B and sodium deoxycholateNote:S2308,2308Δpgk and 2308Δpgk-C of approximately 1×104 CFU/mL were prepared and treated with (A) polymyxin B or (B) sodium deoxycholate.After 1 h of treatment,the survival percentage was determined.Significant differences between 2308Δpgk mutant and S2308 parental strain are indicated by * (P< 0.05),** (P< 0.01).

2.3 PGK调节S2308对巨噬细胞的杀伤作用

为了检测S2308对巨噬细胞的细胞毒性是否受PGK调节，我们用S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C以50,100和1000的MOI感染的原代264.7细胞，测定LDH释放水平.当MOI为50∶1时，在感染后的不同时间，对乳酸脱氢酶的释放水平，菌株之间没有显著差异(图3A).当MOI为100∶1时，在感染后12 h，S2308感染细胞和2308Δpgk-C感染细胞LDH释放率分别为(33.12 ± 1.11)%和(31.93 ± 1.62 )%；而2308Δpgk感染的巨噬细胞的LDH释放率仅为(3.75 ± 0.26 )%(图3B).在感染后24 h，S2308感染细胞和2308Δpgk-C感染细胞LDH释放率分别为(46.38 ± 2.15 )%和(44.55 ± 0.57 )%；而2308Δpgk感染的巨噬细胞的LDH释放率仅为(7.94 ± 0.09 )%(图3B).当MOI为1000:1时，在感染后12 h，S2308感染细胞和2308Δpgk-C感染细胞LDH释放率分别为(59.03 ± 2.08 )%和(57.52 ± 1.59 )%；而2308Δpgk感染的巨噬细胞的LDH释放率仅为(2.95 ± 0.72 )%(图3C).在感染后24 h，S2308感染细胞和2308Δpgk-C感染细胞LDH释放率分别为(73.55 ± 1.57 )%和(71.84 ± 2.38 )%；而2308Δpgk感染的巨噬细胞的LDH释放率仅为(6.83 ± 0.79 )%(图3C).然而，在感染后48 h，感染S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C的巨噬细胞中，所有MOI的细胞都显示出高水平的LDH释放率(图3).结果表明，2308Δpgk突变株在感染后12 h和24 h内在任何MOI中均不诱导巨噬细胞产生高水平的细胞毒性.此外，在感染后48 h，所有菌株对巨噬细胞的细胞毒性均增高，可能是由于长期感染时间而导致营养缺乏的结果.因此，感染后48 h，各菌株对巨噬细胞的细胞毒性无明显差异.结果表明，S2308对细胞的毒性受PGK调节.

图3 PGK调节布鲁氏菌对巨噬细胞的杀伤作用Figure 3 PGK-regulated cytotoxicity of Brucella against macrophagesNote:RAW 264.7 macrophages were infected with S2308,2308Δpgk and 2308Δpgk-C at MOIs of (A) 50,(B) 100 and (C) 1000.Macrophage cytotoxicity was determined at different times post-infection using the LDH release assay.Significant differences among 50 MOI,100 MOI and 1000 MOI are indicated by ** (P< 0.01).

3 讨 论

布鲁氏菌需要适应细胞内外环境，逃避宿主固有和适应性免疫反应，才能成功存活[12].已有研究表明，布鲁氏菌pgk突变株在细胞和小鼠体内的存活能力降低，在控制细菌毒力方面发挥了重要作用[7].为了更好地在宿主细胞中生存，布鲁氏菌逐步具备了适应细胞内环境的能力，如热休克、酸性pH值和高盐[13].在本研究中，我们发现2308Δpgk在高盐、不同pH和热休克的胁迫条件下降低了其存活能力.此外，研究还发现在2308δPGK中，多粘菌素B和脱氧胆酸钠的敏感性增加.这些结果表明PGK可能在布鲁氏菌存活中发挥重要作用.

已有研究报道表明，布鲁氏菌可以诱导巨噬细胞的细胞毒性[14].近年来，Lei和Li等人研究发现，布鲁氏菌的细胞毒性依赖于热休克蛋白HFQ、二元调控系统TceSR和转录调控因子GntR.在本研究中，我们发现，布鲁氏菌的细胞毒性也受到PGK的调节.这意味着布鲁氏菌对巨噬细胞的细胞毒性不仅仅取决于IV分泌系统(T4SS)、二元调控系统(TCS)和转录调控因子.

在本研究中，我们的研究表明，2308Δpgk增加了对体外应激条件、多粘菌素B和脱氧胆酸钠的敏感性.此外，我们还观察到PGK调节布鲁氏菌对巨噬细胞的细胞毒性.这些结果表明PGK参与了布鲁氏菌的胞内外存活.然而，PGK的功能仍需进一步研究.