MGIT 960培养联合GeneXpert MTB/RIF检测在泌尿系结核诊断中的价值

李 静，赵 涛，梁亚萍，仵倩红

(陕西省结核病防治院,陕西 西安710100)

泌尿系结核(Tuberculous urinary，UTB)是临床上一种常见的肺外结核，被认为是一种严重的肺外结核(EPTB)[1-2]，全年约占EPTB病例中的30%～40%，在发展中国家位居肺外结核的第二位[3]。UTB起病隐匿，表现具有多态性与其他细菌感染症状相似，临床症状不明显和缺乏特异性，而且通常在疾病的晚期出现症状，是UTB患者诊断延迟和治疗效果不佳的主要原因[4]。目前筛查较好的尿路造影(CTU)及磁共振泌尿系统水成像技术(MRU)[5]大多基层并未开展，所以对于基层临床诊断除了典型的临床症状最重要的还是依赖于传统的细菌学检测方法。实验室诊断UTB常用的检测方法是：抗酸杆菌(AFB)涂片和分枝杆菌培养[4,6]。AFB涂片虽然快速、价低，但是尿液标本阳性检出率及敏感性都很低，而分枝杆菌培养周期长、不能满足临床早期、快速诊治的需求，故寻求一种新的快速、准确且高敏感度和高特异度的实验室诊断方法成为UTB检测工作的重要目标。GeneXpert MTB/RIF(GeneXpert)是以全自动半巢式实时PCR技术为基础，以rpoB基因为靶基因，在2 h内同时快速检测结核分枝杆菌和利福平耐药。2013年GeneXpert检测作为新型分子诊断技术被WHO推荐用于肺外结核的诊断[7]。但目前GeneXpert用于尿液样本的数据有限，本研究中，通过分析AFB涂片、MGIT 960培养、GeneXpert检测对UTB的诊断效能，进一步评估MGIT 960培养联合GeneXpert检测对UTB的诊断价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象 收集2019年1-12月陕西省结核病防治院收治的185例疑似UTB患者尿液标本的实验室检测资料，纳入同时采用AFB涂片、MGIT 960培养 和GeneXpert检测的112例疑似UTB患者，所有患者临床确诊资料均来源于临床原始病例记录。泌尿系结核患者诊断依据(符合下列三项任何一项者，即可确诊[8]：尿结核菌培养阳性；病理检查证实有结核病变；膀胱镜及(或)X线尿路造影有结核病的典型表现，并结合临床表现和实验室各种检查结果作出诊断。非泌尿系结核患者诊断依据：临床已确诊为其他部位结核患者(包括肺结核，肠结核，子宫内膜结核，结核性胸膜炎，结核性脑膜炎，血行播散性结核)及泌尿系感染，泌尿系肿瘤患者。

1.2 主要试剂和仪器 抗酸染色试剂为实验室自配萋尼染色试剂；MGIT 960检测系统所用的培养仪及试剂均由美国BD公司提供；GeneXpert检测系统及配套试剂盒均购于美国Cepheid公司。

1.3 检测方法 按照无菌采集标本的要求收集留取患者晨尿标本至少5 ml，每份标本均进行AFB涂片，MGIT 960培养和GeneXpert检测。①AFB涂片：严格按照《结核病实验室检验规程》[8]操作。将尿液标本用一次性吸管吸取少许于洁净玻片上涂片，大小约为1 cm×2 cm、干燥后萋尼染色镜检，按照检验规程报告结果。②MGIT 960培养：严格按照《结核病实验室检验规程》[9]操作。取2 ml尿液标本经N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH，终浓度为1.5%)消化去污处理后，室温静置15 min，用磷酸盐缓冲液(pH=6.8PBS)中和后再3000 g离心15 min，弃上清，2 ml PBS缓冲液重悬沉淀物，取0.5 ml重悬液接种至MGIT 960培养管中，加入0.8 ml 营养添加剂(OADC)和杂菌抑制剂(PANTA)的混合液，严格按照说明进行操作。将接种好的MGIT960培养管放入MGIT 960系统中孵育，仪器对分枝杆菌的生长进行自动监测。仪器报阳后采用结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(MPB64)进行结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步鉴定[10]。③GeneXpert检测：严格按照操作说明书进行检验。将1 ml尿液标本与2 ml GeneXpert 系统前处理液混合，拧紧瓶盖，涡旋震荡15 s，室温静置15 min，使标本充分液化，将消化后的2 ml样品用无菌吸管吸入GeneXpert系统测试盒中，上机检测，约2 h报告结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计学分析。以临床确诊患者为参考标准，评价AFB涂片、MGIT 960培养、GeneXpert及MGIT960培养联合GeneXpert检测技术的敏感度、特异度、符合率、阳性预测值和阴性预测值。组间率的比较采用χ2检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 112例患者一般资料 112例患者中男 59例、女 53例，其中62例(55.4%)确诊为泌尿系结核患者(UTB组),18例(29.0%)尿结核菌培养阳性；44例(71.0%)以膀胱镜及(或)X线尿路造影有结核病的典型表现，并结合临床表现和实验室各种检查结果作出诊断。50例(44.6%)临床确诊为非泌尿系结核(非UTB组)患者(包括肺结核25例，肠结核4例，子宫内膜结核2例，结核性胸膜炎4例，结核性脑膜炎3例，血行播散性结核2例及泌尿系感染6例，泌尿系肿瘤4例)。UTB组中男34例(54.8%)、女28例(45.2%)；年龄17～73岁，平均(46.37±15.51)岁；非UTB组中男25例(50.0%)、女25例(50.0%)，年龄19～78岁，平均(45.42±18.13)岁。见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 不同检测方法诊断UTB的效能 以临床确诊泌尿系结核患者为标准，AFB涂片、MGIT 960培养、GeneXpert对UTB的检测效能，见表2。AFB涂片、MGIT 960培养、GeneXpert和MGIT 960培养联合GeneXpert检测的敏感度分别为12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%),29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%),53.2%(33/62,95%CI：40.8%～65.6%)和72.6%(45/62，95%CI：61.5%～83.7%)。尿液标本AFB涂片的敏感度低于MGIT 960培养(χ2=4.87,P<0.05),尿液标本AFB涂片的敏感度低于GeneXpert检测(χ2=22.77,P<0.05),62例临床诊断患者中MGIT 960培养和GeneXpert检测UTB结果有6例患者结果是一致的， MGIT 960培养联合GeneXpert检测的敏感度高于GeneXpert检测(χ2=4.97,P<0.05)、MGIT 960培养(χ2= 23.52,P<0.05)以及AFB涂片(χ2=45.11,P<0.05)。特异度分别为96.0%(48/50),100.0%(50/50)，100.0%(50/50)和100.0%(50/50)；符合率分别为50.0%(56/112),60.7%(68/112)，74.1%(83/112)和84.8%(95/112)。

表2 不同检测方法对UTB诊断效能

3 讨 论

UTB是由结核分枝杆菌引起的慢性、进行性、破坏性病变，是肺外结核的一种，泌尿系结核病中以肾结核最为重要，常常在肺结核病发生或愈合较长时间以后才开始出现临床病象，多继发于肺结核[11-14]。由于UTB早期临床症状不明显和缺乏特异性常常导致诊断的延误，从而影响患者的生存质量并危及生命。传统的细菌学检测方法仍是结核病诊断的“金标准”，然而与痰标本不同，尿液标本实验室检查中AFB涂片查找抗酸杆菌的阳性率很低，而分枝杆菌培养周期长、不能满足临床早期、快速、准确诊治的需求，故寻求一种新的快速、准确且高敏感度和高特异度的诊断方法成为UTB检测工作的重要目标[15-16]。而GeneXpert检测作为新型分子诊断技术，其在肺外结核中的诊断价值已被多项研究评估[17-18]，认为应用GeneXpert检测胸腔积液、脑脊液及骨关节结核部位脓液标本具有较高的敏感度和检测方法的优越性，被认为可用于肺外结核的各种类型的临床标本(如脑脊液和组织样本)检测的确证性诊断试验，但对于尿液的检测效果数据较少，2017年Pang等[19]以L-J固体培养法为诊断标准比较了AFB涂片、L-J固体培养法和GeneXpert三种检测方法在UTB中的诊断敏感度，分别为18.5%(15/81，95%CI：10.1%～20.7%)，45.7%(37/81，95%CI：34.8%～56.5%)和63.0%(51/81，95%CI：52.4%～73.5%)。陈禹等[20]以临床确诊为诊断金标准比较了AFB涂片、MGIT 960培养和GeneXpert三种检测方法在UTB中的诊断敏感度，分别为11.9%(7/59，95%CI：4.9%～22.9%)，42.4%(25/59，95%CI：29.6%～55.9%)和为64.4% (38/59，95%CI：50.9%～76.4%)。本研究中以临床确诊为诊断标准比较了AFB涂片、MGIT 960培养和GeneXpert三种检测方法在UTB中的诊断敏感度，分别为12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%)，29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%)和53.2% (33/62，95%CI：40.8%～65.6%)。相比于其他研究本研究这三种检测方法的敏感度均较低，尤其以MGIT 960培养更为明显，分析原因主要有以下几点：①尿液标本含菌量本身就较低，而此次纳入的临床患者留取的尿液标本均为晨尿，并非24 h尿，含菌量更少使得阳性检出率更低；②此研究中AFB涂片法的尿液标本染色具体实验操作方法同痰液，冷染半个小时，而尿液标本的相比较痰液黏附率本身就很低[21]，冷染时间长固定效果减弱冲片时更容易脱落，且AFB涂片需抗酸杆菌达到5×103～1×104个/ml的浓度才能检测出阳性结果，涂片样本量难以达到检测需求故而阳性检出率更低；③MGIT 960培养对环境要求极高，但前处理过程较为复杂，尿液标本在处理过程中所用的消化条件与痰液相同，而该处理过程更适合痰液，对于含菌量较少的尿液标本来说过于严苛，使得尿液样本中的大多结核分枝杆菌暴露于碱性环境中[22]，从而使一定比例的结核分枝杆菌被杀死失去活性，且最终培养的加样量仅有500 μl载菌量较低，从而导致MGIT 960培养阳性检出率低；④GeneXpert虽操作过程简单，但加样量也只有1 ml，载菌量也较低；⑤有研究发现结核分枝杆菌在感染患者的尿液中间歇排泄，单个尿液标本(如晨尿、随机尿)比24 h尿标本更可能呈现假阴性[23]，这也是此次研究这几种检测方法敏感性均较低的主要原因。

本研究中，AFB涂片法的敏感度最低，其中有2例涂片阳性的疑似患者临床最终确诊为非泌尿系结核。GeneXpert检测的敏感度明显高于其他两种检测方法，但MGIT 960培养和GeneXpert的检测阳性者仅有6例为同时阳性，重叠比例较低，这可能的原因为：本研究中大多UTB患者在留取样本之前已经在当地结核病院进行了一段时间的抗结核药物治疗，而结核菌培养主要针对检测的是活的结核分枝杆菌，GeneXpert主要检测的是结核分枝杆菌的DNA，已使用抗结核药物将会影响结核分枝杆菌的培养阳性检出率，且MGIT 960培养与GeneXpert的细菌浓度阳性阈值检测限也不相同(前者为100条/ml，后者为131条/ml)。在这三种检测方法中GeneXpert检测有明显的优点：用时短、2 h可在患者标本中直接检测结核分枝杆菌，且能检测利福平是否耐药，但是尽管现代分子生物学技术在结核病研究中发挥着越来越重要的作用，但是结核杆菌培养方面依然有着不可替代的作用，而且至今仍然是结核及肺外结核诊断的金标准[24]，较AFB涂片的敏感性要高，对于排菌量小、涂片检测阴性的患者能及时发现传染源，对疫情控制有重要价值，在结核病的诊断、菌种鉴定、药物敏感性试验为了更好的为临床提供诊断依据，所以为了提高阳性检出率，避免漏检，更好的利用每种检测方法的优点。本研究采用MGIT 960培养联合GeneXpert检测，得出其敏感度为72.6%(45/62，95%CI：61.5%～83.7%)远远高于GeneXpert检测、MGIT 960培养和AFB涂片三种检测方法在UTB中的诊断敏感度：53.2% (33/62，95%CI：40.8%～65.6%)(χ2=4.97，P<0.05)；29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%)(χ2= 23.52，P<0.05)；12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%)(χ2=45.11，P<0.05)。所以MGIT 960培养联合GeneXpert检测在UTB中有较高的诊断优势，可以进一步推广。

本研究也存在一定的局限性：①虽然统计了全年疑似病例，但是最终纳入的UTB患者样本量仍然较小；②本研究中MGIT 960培养对尿液标本前处理使用的是痰液的处理方式，降低了MGIT 960培养对尿液标本中结核分枝杆菌的检出率；③由于实验室检测条件有限，对于不相符的检测结果未能进行进一步研究。基于此次的研究结果， MGIT 960培养联合GeneXpert检测在尿液样本中检测结核分枝杆菌的优异性还需要更大的样本量来验证，并对于不相符的结果最好能够进行基因测序等进一步验证。

综上所述，GeneXpert检测对UTB早期诊断具有较高的敏感度和特异度且高于传统的抗酸染色涂片镜检和结核菌培养，但因其检测量只有1 ml，可能导致结核分枝杆菌载菌量较低而使检测敏感度较低，另外为了鉴定结核分枝杆菌并对抗结核药物进行药物敏感性试验，仅仅依靠PCR方法是不够的。而MGIT 960培养联合GeneXpert检测，不仅结合了MGIT 960培养检出活的结核分枝杆菌以及GeneXpert早期快速的优势，更好的发现传染源并进行菌种鉴定，也补充了GeneXpert检测技术在耐药检测方面的单一性，能更好的指导临床用药及合理调整用药方案，对患者的诊断治疗以及耐药筛查都有很大的帮助，也大大降低了漏诊率，筛查意义更重大。