miRNA-26a-5p靶向调控蛋白酪氨酸磷酸酶基因对冠心病模型大鼠主动脉内皮细胞炎症损伤的影响

刘博强，张伟宁，忽海洋

(铜川市人民医院,陕西 铜川 727000)

冠心病(Cardiovascular heart disease，CHD)即冠状动脉粥样硬化性心脏病，是指由于冠状动脉结构或功能异常引起的心肌缺血、缺氧或坏死，进而发生的心脏疾病，其病死率居世界首位，对人类健康构成严重威胁[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度为20～23个核苷酸的非编码RNA，在真核生物中广泛表达并高度保守，可以调控基因的表达，靶向mRNA的功能，抑制其翻译成蛋白质的过程，且可广泛参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程[2]。近年来，研究人员在冠心病中发现了异常表达的miRNA，并提出这些miRNA可影响内皮细胞的细胞行为，从而影响冠心病的发生和发展[3-4]，但其作用机制尚未完全明确。miRNA-26a-5p在多种组织中广泛表达，并被证实可通过调控PI3K/AKT通路影响冠心病主动脉内皮细胞凋亡[5]，蛋白酪氨酸磷酸酶基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)作为PI3K/AKT通路的重要基因，可能是miRNA-26a-5p的调控靶点[6]。本文探究miRNA-26a-5p靶向调控PTEN对CHD模型大鼠主动脉内皮细胞炎症损伤的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选取22只健康SD雄性大鼠(鼠龄3～4个月，体重140～160 g)，由空军军医大学动物实验中心提供，常规饲料喂养，正常饮水，7 d后开始实验。入组大鼠的选取和应用均符合美国国家卫生研究院实验动物护理和使用指南要求，并通过伦理委员会审查。

1.1.2 其他材料：20%胎牛血清(FBS)、DEME-F12培养基(C11330500BT)均购自美国Invitrogen公司，生物化学分析仪购自美国Thermo Fisher公司，miR-140类似物(mimic)购自美国Thermo Fisher公司，RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，实时荧光定量PCR试剂购自美国Bio-Rad公司，ELISA试剂检测盒购自上海碧云天生物科技有限公司，Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。

1.1.3 实验模型构建及分组：按随机法分成将22只大鼠分为两组(模型组和正常组)，每组11只。正常组大鼠不进行特殊处理，常规饲料喂养，30 g/d。模型组大鼠采用文献[7]制备冠心病模型大鼠的方法(高脂饲料喂养法)进行饲喂。高脂饲料组成：基础饲料、胆固醇、猪油、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶，比例分别为94.30%、2.00%、3.00%、0.50%、0.25%。采用心电图评价冠心病大鼠模型制备情况，成功标准为ST 段下移及T波改变，本研究中模型组11只大鼠冠心病模型均制备成功，成功率100%。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验：①血钙和血脂检测：在大鼠腹部进行主动脉取血，离心5 min后取血浆1 ml，用生物化学分析仪检测大鼠主动脉血总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高/低密度脂蛋白胆固醇(HDLC/LDLC)、Ca2+的含量，进行3次检测，求取平均数并记录数据。②基因及蛋白指标检测：将模型组大鼠麻醉后处死，收集主动脉内皮组织，切取部分组织进行RNA提取，剩余的部分组织用于细胞培养。采用实时荧光定量PCR方法检测miRNA-26a-5p、PTEN、caspase-1 mRNA相对表达量；采用Wester blot法检测PTEN、caspase-1蛋白相对表达量。

1.2.2 细胞实验：①细胞培养及分组：将剩余的部分组织用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗后在300 g下离心10 min，去除上清后用20% FBS DEME-F12培养液培养细胞，培养条件为37 ℃、5% CO2。转染前1 d，将待转染细胞接种至96孔板上，接种密度为2×105/cm2，待细胞融合率到达60%～80%时，使用Lipofectamine 2000进行miRNA-26a-5p mimic转染，并同步设置空白对照组(不转染)、阴性组(转染与目的基因不相干基因片段)、miRNA-26a-5p mimic组(转染miRNA-26a-5p过表达)、miRNA-26a-5p inhibitor组(转染miRNA-26a-5p抑制物)、miRNA-26a-5p inhibitor+siPTEN组(双转染miRNA-26a-5p+siPTEN)，验证转染效率后进行后续试验步骤。②基因、蛋白指标及炎症因子检测：检测空白对照组、阴性组、miRNA-26a-5p mimic组、miRNA-26a-5p inhibitor组和miRNA-26a-5p inhibitor+siPTEN组中miRNA-26a-5p、PTEN、caspase-1 mRNA及蛋白相对表达量及IL-18、IL-10、IL-6、IL-1β水平：IL-18、IL-10、IL-6、IL-1β的浓度水平用ELISA试剂盒检测，其余检测方法同1.2.1基因及蛋白指标检测。

2 结 果

2.1 模型组和正常组大鼠血钙和血脂水平对比 与正常组对比，模型组的TC、TG、LDLC和Ca2+水平均显著高于正常组(均P<0.05)。

表1 大鼠血钙和血脂水平对比(mmol/L)

2.2 模型组和正常组主动脉内皮组织miRNA-26a-5p、PTEN、caspase-1 mRNA表达水平及PTEN、caspase-1蛋白表达水平对比 见图1、2。模型组miRNA-26a-5p mRNA及蛋白水平低于正常组，PTEN、caspase-1 mRNA表达水平以及PTEN、caspase-1蛋白表达水平均高于正常组(均P<0.05)。

注：与正常组相比，*P<0.05

注：与正常组相比，*P<0.05

2.3 各组主动脉内皮细胞miRNA-26a-5p、PTEN、caspase-1 mRNA表达水平及PTEN、caspase-1蛋白表达水平对比 见图3、4。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与miRNA-26a-5p

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与miRNA-26a-5p mimic组相比，#P<0.05

相比于空白对照组，miRNA-26a-5p mimic组miRNA-26a-5p mRNA相对表达显著升高，PTEN、caspase-1 mRNA相对表达降低，PTEN、caspase-1蛋白表达升高(均P<0.05)；miRNA-26a-5p inhibitor组miRNA-26a-5p mRNA相对表达降低，PTEN、caspase-1 mRNA相对表达升高，PTEN、caspase-1蛋白表达降低(均P<0.05)；与miRNA-26a-5p mimic组相比，miRNA-26a-5p inhibitor + siPTEN组的miRNA-26a-5p相对表达降低，PTEN、caspase-1 mRNA相对表达均升高，PTEN、caspase-1蛋白表达降低(均P<0.05)。

2.4 各组炎症因子表达水平对比 见表2。与空白对照组、阴性组相比，miRNA-26a-5p mimic组IL-1β、IL-6和IL-18水平降低、IL-10升高(均P<0.05)，miRNA-26a-5p inhibitor组与之相反(均P<0.05)；与miRNA-26a-5p mimic组相比，miRNA-26a-5p inhibitor组IL-1β、IL-6和IL-18水平升高，IL-10降低(均P<0.05)。

表2 各组炎症因子表达水平(pg/ml)

3 讨 论

冠心病是动脉粥样硬化最常见的病理类型，严重危害人类健康。研究[8]表明，冠心病的重要病理基础之一即为血管内皮细胞损伤，大多数冠状动脉事件与动脉内皮功能障碍密切相关。血管内皮细胞功能不但包括血液及组织液的代谢交换，还能够分泌或产生生物活性物质，从而维持血管张力、参与致栓、抗栓物质的合成[9]。目前治疗冠心病通过恢复冠状动脉血流来减少梗死面积，降低病死率，但是在发病过程中会诱发细胞内钙、钠和氢离子富集，导致组织酸中毒，细胞内环境的快速变化会引起严重的细胞毒性，这种损伤是一种不可逆的损伤，而这种损伤发生在创伤、溶栓治疗、经皮腔内冠状动脉成形术和器官移植等多个过程中[10-12]。因此，研究冠心病损伤过程中的细胞和分子机制，对治疗冠心病引起的损伤需求迫切。

本研究采用高脂饲料饲喂大鼠制备冠心病模型大鼠，是因为人类冠心病的发生与长期高脂高糖饮食习惯有很大的关系，高脂高糖饲喂大鼠诱导冠心病与人类冠心病的发生最为相似。单纯性高糖高脂饮食的大鼠机体内会产生过多的活性氧，活性氧会抑制血管内皮的一氧化氮合酶，进而引起血管舒张功能异常[13]。另外，长期高脂高糖的饮食习惯不仅会引起血管闭塞，还会引起一系列由血管功能失常诱发的心血管疾病，因此，预防和治疗冠心病应从改善血管内皮功能着手。

miRNA发生在细胞的整个生物学过程中，与多个生理过程均有关，主要相关的生理过程有细胞的增殖、凋亡、转移和造血作用，并且参与了大部分细胞生理过程[14]。miRNA可下调胰岛素生长因子，抵抗缺血再灌注引起的血管内皮细胞凋亡，可下调聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，抵抗缺血再灌注引起的血管内皮细胞凋亡，可通过抑制钙调节神经磷酸酶，减轻相关的动力蛋白的去磷酸化，从而减少细胞凋亡，可通过减少心肌损伤后的梗死面积和心肌酶，降低细胞凋亡水平[15-16]。

PTEN在心血管病中发挥着重要的作用，其被鉴定为miRNA的靶基因，PTEN/PI13K/AKT通路参与了细胞凋亡的调控过程。miRNA可抑制PTEN/PI3K/AKT信号传导，miRNA-26a-5p可靶向负调控PTEN等基因，影响血管内皮细胞凋亡。本研究结果显示，转染miRNA-26a-5p比未转染miRNA-26a-5p内皮细胞的PTEN及其蛋白水平显著下降，但转染miRNA-26a-5p抑制剂比未转染miRNA-26a-5p内皮细胞的PTEN及其蛋白水平显著升高，说明miRNA可抑制冠心病大鼠的PTEN基因，miRNA可负向调控内皮细胞的PTEN，该结果与文献[17-18]报道结果一致。此外，内皮细胞转染miRNA-26a-5p后，其比转染不相干序列的IL-10水平明显升高，IL-1β、IL-6、IL-18水平显著降低，但转染miRNA-26a-5p抑制剂后，其比转染不相干序列的IL-10水平明显降低，IL-1β、IL-6和IL-18水平显著升高，说明miRNA-26a-5p对冠心病大鼠主动脉内皮细胞的炎症因子具有规律性调节作用。文献[19-20]报道miRNA-26a-5p对血管内皮细胞具有保护作用，该保护机制可能与miRNA-26a-5p调控血管内皮相关的炎症因子有关。

与正常大鼠比较，冠心病大鼠的血钙、血脂、miRNA-26a-5p、PTEN、caspase-1 mRNA表达和PTEN、caspase-1蛋白表达水平均发生显著变化,其中PTEN是当下结构与功能最明确的一种炎性体，在动物动脉粥样硬化斑块中能够激活，在冠心病患者主动脉中过表达显著，据此可推测，miRNA-26a-5p通过靶向抑制PTEN，抑制血管内皮细胞的相关炎症因子的水平，从而减缓内皮细胞炎症损伤，实现保护内皮细胞的作用[20]。

综上所述，冠心病大鼠主动脉内皮细胞中miRNA-26a-5p呈高表达、PTEN低表达，miRNA-26a-5p靶向PTEN能够使IL-1β、IL-6和IL-18炎症因子释放减少，减缓主动脉内皮细胞炎症损伤，具有内皮细胞保护作用。