人工脱色过氧化物酶催化降解苋菜红活性研究

向亨芳,刘 姣,杜可杰,林英武

(南华大学 化学化工学院,湖南 衡阳 421001)

0 引 言

目前，我国纺织工业达到甚至领先于世界先进水平，但是染料的后处理给生态环境带来了巨大压力。纺织工业的特点是产生大量的废水、高度污染染料和添加剂，纺织品废水如果不经过适当处理排入河流，会严重影响水生植物的光合过程和减少水中的溶解氧，其中许多对水生植物群和人类具有高度毒性[1]。偶氮染料是纺织工业使用最广泛的合成染料之一，是染料废水中典型的主要污染物。此外，偶氮染料如果在不适当的条件下(如乏氧条件)分解通常会产生比原始染料毒性更强的化合物，如芳香胺等，此类化合物对生命体具有致突变性和致癌作用[2]。偶氮染料废水常规处理方法包括吸附处理、膜分离、光催化降解、电化学高级氧化法等。此类处理方法具有较多的缺点，如导致大量沉淀物的产生使形成的污泥难以处理、降解效率低等，因此寻找一种更加高效、清洁的染料处理方法成为亟待解决的问题[3]。与物理及化学方法相比，生物修复方法由于具有高效和环境友好的优点，因此在纺织废水处理中被逐渐重视起来。自然界中已经存在多种能够降解工业染料的生物酶，如广泛存在于微生物中的染料脱色过氧化物酶(DyPs)[4]，其属于血红素过氧化物酶类家族。但由于其通常需要在酸性较低(通常为pH3～4)的环境中才能发挥较好活性导致其应用受到限制[5-6]。而人工酶由于便于修饰及表达纯化，在近几年发展非常迅速，多种具有不同功能的人工酶涌现出来[7]。通过对天然酶的改造或者人工设计，为筛选出高效的染料脱色酶提供了条件。Y.Yu等通过在抹香鲸肌红蛋白中设计功能性氧化酶模型实现了电子转移(ET)速率比天然氧化还原酶高400倍的目标[8]。本课题组以肌红蛋白作为蛋白质骨架设计了多种染料脱色过氧化物酶，其中通过在蛋白表面88位点引入色氨酸，设计了第三代染料脱色过氧化物酶F43Y/F138W/P88W Mb，其对活性蓝19的催化活性超过大部分天然染料脱色过氧化物酶[9]。这也表明，对肌红蛋白为进行合理的设计，可以筛选出高效的人工染料脱色酶。之前的研究表明，天然DyPs中多个酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基的存在，例如弯曲高温单孢菌TcDyP中的Tyr330、Tyr332、Trp263和Trp376，对染料脱色起着至关重要的作用[10]。本课题组前面报道的第二代染料脱色过氧化物酶F34Y/F138W Mb、第三代染料脱色过氧化物酶F43Y/F138W/P88W Mb，同样显示了色氨酸的合理设计引入可以增强人工酶的染料脱色活性[9,11]。因此构建了F43Y Mb、F43Y/F138W、F43Y/F138W/P88W Mb三种人工过氧化物酶，选择了在纺织生产中使用非常广泛的偶氮染料-苋菜红作为催化底物，详细研究了人工酶对苋菜红的氧化脱色效果。我们采用紫外-可见分光光度计对F43Y Mb、F43Y/F138W Mb、F43Y/F138W/P88W Mb的苋菜红催化降解进行了表征，通过快速截留光谱仪对三个人工酶的苋菜红的催化降解动力学进行了研究。结果表明，人工脱色过氧化物酶F43Y/F138W/P88W Mb具备高效催化降解苋菜红的能力。

1 实验部分

1.1 野生型及突变体蛋白制备

苋菜红购买自阿拉丁公司(中国上海)，抹香鲸野生型肌红蛋白(WT Mb)及突变体蛋白F43Y Mb、F43Y/F138W Mb、F43Y/F138W/P88W Mb在大肠杆菌BL(21)DE3中表达并按照已有方法进行纯化[12-13]，通过质谱进一步确认结果。其他所有化学试剂均为商业产品，纯度为分析纯。

1.2 紫外可见光谱研究

使用Hewlett-Packard 8453紫外可见光谱仪，检测在人工酶同时加入H2O2和苋菜红后的200～700 nm范围内吸光度变化。采用吡啶光谱法测定蛋白的摩尔消光系数并用于蛋白浓度计算[14]，F43Y Mb、F43Y/F138W Mb和F43Y/F138W/P88W Mb的消光系数分别为ε404=146 L/(mmol·cm)、ε405=146 L/(mmol·cm)和ε407=160 L/(mmol·cm)。

1.3 动力学研究

采用快速停流光谱仪(SF-61DX2Hi-TechKinetasystTM)测定F43Y Mb、F43Y/F138W Mb和F43Y/F138W/P88W Mb的催化效率。反应在25 ℃下进行，将高浓度苋菜红加入到10 μmol/L蛋白中预混合，再与2 mmol/L H2O2等体积反应，苋菜红终浓度为0～140 μmol/L，监测521 nm处吸光度变化以确定初始速率，初始速率与苋菜红浓度的关系符合米氏方程(Michaelis-Menten equation)[14]：

υ/[蛋白质]=kcat[苋菜红]/(Km+[苋菜红])

2 结果与讨论

2.1 人工脱色过氧化物酶催化降解苋菜红光谱研究

苋菜红是一种典型的偶氮染料，被广泛用于纤维、皮革、纸张的染色中，但是其也具有偶氮染料的共性——致突变性。以苋菜红作为催化底物，通过快速停流光谱仪检测三种突变体蛋白的染料脱色活性，设计并纯化了三突变体蛋白F43Y/F138W/P88W Mb，该突变体蛋白138位点和88位点被色氨酸替代。同时为系统研究色氨酸及其替代位点对于催化活性的影响，我们纯化了双突变蛋白F43Y/F138W Mb和单突变蛋白F43Y Mb。蛋白终浓度均为5 μmol/L，苋菜红终浓度为30 μmol/L，缓冲液为100 mmol/L、pH 7.0的磷酸钾缓冲液。在H2O2终浓度为1 mmol/L条件下，F43Y Mb表现出了一定的苋菜红催化降解能力。通过对其521 nm处的吸光度进行分析发现，其对苋菜红催化效率较低，约150 s后催化速率开始下降(图1(b))。

图1 不同蛋白降解苋菜红紫外可见光谱Fig.1 UV-vis spectra of amaranth degraded by different proteins

在相同条件下，F43Y/F138W Mb表现出了较快的苋菜红催化降解能力(图1(c))。对其521 nm处吸光度分析看出其催化速率明显比F43Y Mb提高，其在20 s内即可将苋菜红底物脱色降解(图1(d))，该结果显示，在138位点引入色氨酸可以显著增强人工蛋白酶的活性。为了验证这一猜想，在合理设计后，于88位引入色氨酸基团，得到F43Y/F138W/P88W Mb蛋白并研究了其活性。从结果可以看出(图1(f))，苋菜红在521 nm处的特征吸收峰随着时间推移显著降低，在10 s之内被快速降解。从实验结果看，催化降解苋菜红活性能力F43Y/F138W/P88W Mb最大，F43Y/F138W Mb次之，F43Y Mb最小，这说明蛋白结构中合理位点的色氨酸，在染料催化降解中起了重要的促进作用。

2.2 人工脱色过氧化物酶对苋菜红的催化动力学分析

为了进一步探究三种人工脱色过氧化物酶的活性，我们在最佳条件下(蛋白浓度：5 μmol/L，H2O2浓度：1 mmol/L)改变苋菜红浓度(0～140 μmol/L)，测定了酶催化苋菜红降解的动力学变化(图2(a))。将kobs与初始速率图用米氏方程拟合得到动力学参数kcat和Km(表1)。从最终实验结果可以看出，三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的活性最高，其转化数kcat分别比F43Y Mb提高了约39倍，比F43Y/F138W Mb提高了约5倍。但是三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的Km值比F43Y Mb大了约1.2倍，比F43Y/F138W Mb大了约4.7倍。三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的整体催化效率(kcat/Km)相比F43Y Mb提高了约33倍，而双突变体F43Y/F138W Mb的整体催化效率(kcat/Km)与F43Y/F138W/P88W Mb差不多，比突变体F43Y Mb整体催化效率(kcat/Km)提高了约30倍。尽管双突变体F43Y/F138W Mb的kcat值偏低，但是其Km值相对三突变体F43Y/F138W/P88W Mb来说降低了约4.6倍，抵消了kcat降低带来的催化效率的降低，从而导致整体催化效率的提高。三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的Km值最大，说明它与苋菜红底物之间亲和力最小，我们推测这可能是因为88位色氨酸的出现增大了空间位阻，使苋菜红分子更难接近血红素边缘附近。

图2 不同蛋白催化速率与催化效率Fig.2 Catalytic rate and efficiency of different proteins

表1 在pH 7的100 mmol/L Kpi缓冲液中，三种突变体蛋白降解苋菜红的动力学参数Table 1 Kinetic parameters of amaranth degradation by three mutant proteins in pH7,100 mmol/L Kpi buffer

3 总 结

受天然脱色过氧化物酶的结构特征的启发，我们系统构建了并纯化了三个突变体蛋白F43Y Mb、F43Y/F138W Mb和F43Y/F138W/P88W Mb，即通过在肌红蛋白的血红素口袋中43位点和138位点、以及蛋白表面的88位点进行改进，并对三个突变体蛋白的苋菜红脱色降解进行了研究。结果表明，三突变体蛋白F43Y/F138W/P88W Mb相对其它两个突变体蛋白而言具有较高的苋菜红催化速率，但是由于88位色氨酸的引入，导致其Km高于其它两个突变体蛋白。F43Y/F138W Mb、F43Y/F138W/P88W Mb整体催化效率(kcat/Km)比无色氨酸引入的单突变体蛋白F43Y Mb要高，这也证实了色氨酸的合理引入，有利于提高蛋白的脱色过氧化物酶活性。本研究阐明了色氨酸在脱色过氧化物酶活性中的重要性，为今后人工脱色过氧化物酶的设计提供了理论依据。后面还需对人工脱色过氧化物酶活性机理及应用条件进行深入研究。