“ 红颜”草莓茎尖组织培养及其果实芳香成分分析

梁正鲜，黄 强，张馨予，李春斌

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116605)

草莓属于蔷薇科草莓属草本植物，目前已知的草莓属(Fragaria)约有24种[1]，经过育种学家的不断选育，草莓栽培品种己超过两千。草莓果实鲜美红嫩，无果皮，果肉多汁，味道爽口怡人，不仅富含糖类、膳食纤维、维生素、矿物质和氨基酸等营养物质，而且含有花青素等功能成分[2]，深受人们的喜爱。因其具有适应性强、结果早、生长周期短的优势，成为世界范围内的重要经济作物[3]。草莓多以无性繁殖为主[4]，该繁殖方式导致草莓极易感染病毒，草莓本身对病毒并没有免疫能力，目前尚没有特效方法或外用药剂可以治愈病毒病，获得草莓无病毒苗的有效方法仍是通过组织培养脱毒，得到无病毒试管苗，然后将无病毒苗进行扩繁，从而满足市场的需求[5]。建立“红颜”草莓快速繁殖体系，对草莓脱毒苗的工厂化生产具有重要意义。

芳香成分是构成和影响果实风味和加工质量的主要因素，草莓具有浓郁的香味，成熟草莓果实香气由多种芳香成分共同作用而成，这些芳香物质只占草莓鲜重的0.001%～0.010%[7]，但对果实风味起着重要的作用。本试验采用固相微萃取(Solid-Phase Microextraction,SPME)技术与气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)联用技术相结合的方法对“红颜”草莓果实的芳香成分进行分析，以确定“红颜”草莓果实的芳香成分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料为大连市高原草莓脱毒苗繁育工程研究中心草莓种植基地栽培的“红颜”草莓。

SPME固相萃取头，GCMS-QP2010plus气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司。

1.2 方 法

1.2.1 外植体消毒

从室外栽培的“红颜”草莓植株上剪取4 cm匍匐茎，置于75%酒精擦拭消毒过的冰盒中，带回实验室后用洗洁精洗去匍匐茎上的油脂，自来水流水冲洗1～2 h，沥干水分置于无菌瓶内，在无菌室中用75%酒精振荡洗涤45 s，立即用无菌水冲洗30 s，后置于2%次氯酸钠溶液中振荡洗涤8 min，取出后用无菌水冲洗5次，每次30 s，再用无菌吸水纸吸干匍匐茎表面水分备用。

1.2.2 “红颜”草莓初代培养激素浓度配比筛选

将处理好的“红颜”草莓茎尖置于解剖镜下用解剖刀逐层剥离外层幼叶直至露出嫩黄色的半球形子弹头状的顶端分生组织，切取大小为0.1～0.5 mm的茎尖，接种于装有50 mL诱导培养基的培养瓶中进行茎尖诱导萌发培养。基础培养基选择MS培养基，每升MS培养基中加入30.0 g蔗糖和7.0 g琼脂，培养基pH调节至5.8。按照《草莓脱毒种苗生产技术规程》中对草莓初代培养基的激素浓度要求，添加不同浓度的6-BA和相同浓度不同种类的生长素(吲哚乙酸、α-萘乙酸)，每瓶接种5个茎尖，每种配方接种10瓶，室温(25±2)℃，光强度1 500 lx，每天光照12 h，统计接种14天后成活率和生长情况。

1.2.3 “红颜”草莓芽增殖分化培养激素浓度配比筛选

将长势良好的试管苗接种到装有50 mL继代培养基的接种瓶中进行芽增殖分化培养，基础培养基选择MS培养基，每升MS培养基中加入30.0 g蔗糖和7.0 g琼脂，培养基pH为5.8。按照《草莓脱毒种苗生产技术规程》[7]中对草莓初代培养基的激素浓度要求，添加不同浓度的6-BA和相同浓度不同种类的生长素(吲哚乙酸、α-萘乙酸和吲哚丁酸)，每瓶接种3个脱毒苗，每个配方接种5瓶，室温(25±2)℃，光强度1 500 lx，每天光照12 h，统计接种14天后芽增殖率和生长情况。

1.2.4 “红颜”草莓芳香成分分析

(1)SPME取样。取样前先将固相微萃取头在气相色谱进样口以250 ℃温度进行老化2 h。选取成熟的“红颜”草莓新鲜果实用刀片切碎后，连同转子一起迅速装进15 mL样品瓶内，样品瓶的上部留2 cm空隙，加盖密封。使老化好的萃取头不碰到果肉插入样品瓶的顶空部分，在集热式恒温加热磁力搅拌器上萃取40 min，萃取温度40 ℃，然后将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪，250 ℃解析5 min，进行气相色谱-质谱检测分析。

(2)GC-MS分析条件。色谱条件：DB-5毛细色谱柱(1.0 μm，0.32 mm×50 m)；载气为稀有气体He，不分流，恒流1 mL·min-1；进口温度250 ℃。柱温起始温度为40 ℃，保持1 min后以5 ℃·min-1的速度升到120 ℃，再以8 ℃·min-1的速度升到200 ℃，最后以12 ℃·min-1的速度升到250 ℃并保持7 min。质谱条件：离子源温度设置为200 ℃；电离方式为EI，电子能量70 eV。

2 结果与分析

2.1 激素浓度对“红颜”草莓生长的影响

不同浓度6-BA与相同浓度的两种生长素的不同配比对“红颜”草莓茎尖的诱导在成活率上存在一定差异，各处理培养基配方及茎尖成活率见表1。

表1 初代培养基激素对茎尖生长的影响

综合分析表1，6-BA浓度对“红颜”草莓茎尖成活率有较大影响，随6-BA浓度的增大，茎尖成活率先增大后减小，6-BA浓度为0.4 mg·L-1时茎尖成活率最高。从不同类型生长素对“红颜”草莓茎尖的诱导成活率来看，IAA的效果优于NAA；两种激素综合来看，A3>A4>A0>A2>A6>A5>A1，即在添加有0.40 mg·L-16-BA的培养基中添加0.10 mg·L-1IAA茎尖成活率最高，成活率可达65%，长势良好；其次是在添加有0.4 mg·L-16-BA的培养基中添加0.10 mg·L-1NAA，成活率达58%，长势较好。

2.2 激素浓度对“红颜”草莓芽分化增殖的影响

不同浓度6-BA与相同浓度的三种生长素的不同配比对“红颜”草莓茎尖的诱导在芽增殖倍数上存在一定差异，各处理培养基配方及继代脱毒苗的芽增殖分化情况见表2。

表2 芽增殖分化培养基不同激素对芽增殖的影响

综合分析表2，不同浓度6-BA对“红颜”草莓芽增殖分化具有较大影响，分化适宜浓度范围为0.30～0.50 mg·L-1，在6-BA的适宜浓度范围内，随着6-BA浓度的增大，分化效果提高，超过0.50 mg·L-1植株则会发生萎蔫、枯黄的现象，如C1、C2、C3处理。不同类型生长素对“红颜”草莓芽增殖分化效果，IAA的效果最好，其次为NAA；综合两种激素配比的芽增值倍数，处理C5的效果最好，即在添加0.50 mg·L-16-BA的培养基中添加0.10 mg·L-1IAA效果最好，增值倍数可达2.67，并且植株健壮，长势良好，叶片无枯黄斑驳等现象。

2.3 “红颜”草莓GC-MS分析结果

气相色谱-质谱联用仪检测所得的“红颜”草莓果实中挥发性物质成分气相色谱-质谱分析总离子图如图1。各组分质谱经计算机谱库检索及化源网CAS号查询分析，检测出的挥发性物质成分见表3。

图1 “红颜”草莓挥发性成分的总离子图

表3 “红颜”草莓中挥发性物质化合物成分气相色谱-质谱分析结果

续表3 “红颜”草莓中挥发性物质化合物成分气相色谱-质谱分析结果

本实验从“红颜”草莓成熟果实中共检测出76种挥发性物质，占总峰面积的55.18%。醇类化合物10种，占总峰面积的21.96%；酯类化合物43种，占总峰面积的19.85%；醛类化合物8种，占总峰面积的9.84%；酮类化合物4种，占总峰面积的0.10%，主要化合物占总峰面积的51.81%。占峰面积含量相对较高的几种化合物依次为：橙花叔醇>己酸甲酯>芳樟醇>2-己烯醛>桃醛。据有关研究报道[6]，芳香类物质对果实香气的贡献是依据香气含量/香气阈值来划分的，其中具有较高香气值的挥发性物质成为特征香气成分，成熟草莓中酯类和呋喃酮类的含量越高，果实的风味越浓。

3 结果与讨论

激素是影响植物组织培养的一个关键因素，在植物组织培养中，由于激素的积累作用，要有效的诱导一种植物产生苗或促进嫩茎良好的增殖，所需求的激素种类和浓度在不同的培养阶段是不同的[8]。本研究以优质“红颜”草莓匍匐茎作为外植体，研究发现，在配方为MS+0.4 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1IAA的培养基中茎尖的成活率最高，可达到65%，且长势良好；在配方为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1IAA的培养基中芽的增殖效果最佳，增殖倍数可达2.67，并且植株健壮，长势良好，随着6-BA浓度的增加，“红颜”草莓芽增殖倍数增大，但增殖倍数过大时容易引起变异，因此实验中6-BA的浓度不宜过高。

SPME技术结合GC-MS可以避免使用大量的有机溶剂，简化样品前处理时间，是一种准确、快捷、有效的芳香成分测定方法。本研究利用SPME-GC-MS技术，在成熟的“红颜”草莓果实中共检测出挥发性化合物76种，占总峰面积55.18%，含量相对较高的芳香成分依次为：橙花叔醇>己酸甲酯>芳樟醇>2-己烯醛>桃醛，对成熟的“红颜”草莓果实风味贡献值大的酯类化合物占总峰面积的19.85%，为鲜食“红颜”草莓品质评价提供科学依据。