植物精油结合壳聚糖涂膜对板栗采后的保鲜效果

龚晟兰，杨治华，吴富敏，甘 维，徐振鑫

（湖南应用技术学院农林科技学院，湖南常德 415000）

板栗（Castanea mollissimaBlume）为壳斗科（Fagaceae）栗属（CastaneeMill.）植物。板栗是我国著名的干果，也是重要的木本粮食，在我国的种植历史逾3000年[1]。板栗的营养价值高，且具补肾益气、养胃健脾功效[2-3]。板栗为具休眠特性的顽拗性种子。采后的板栗易失水，且对失水敏感性强，失水不仅影响其保存性，也会影响其质构特性[4]。板栗采后生理代谢旺盛，极易受病原微生物的侵染而发生霉变[5]。在采后贮藏过程中，栗仁易出现呈白色粉末状，即“石灰化”的生理病害[3]。因此，板栗是最难保藏的干果，我国每年板栗采后的损失率超过30%。

在自然状态下板栗采后的呼吸非常旺盛，呼吸消耗很大，不利于板栗的中长期贮藏[6]。涂膜保鲜是常用的食品保鲜方法之一，利用涂膜材料在果蔬表面形成一层薄膜，可一定程度降低果蔬的呼吸强度和蒸腾失水速率，从而达到自发气调保鲜和减少水分损失的目的[7-8]。王大红等[9]将纳他霉素复合防腐剂与普鲁兰多糖复合对板栗进行涂膜保鲜，降低了板栗腐烂率，延长了保鲜期。

植物精油，又称香精油、芳香油和挥发油，是存在于植物中的一类具芳香气味、可随水蒸气蒸馏出来而又与水不相混溶的挥发性油状成分的总称，是植物的次生代谢产物。植物精油具有抑菌、驱/杀虫、抗氧化等作用[10-14]。Nehal等[15]在对蚕豆根腐菌体外抑菌实验中发现，2%（v/v）的柠檬草精油和百里香精油能完全抑制其生长。也有将植物精油与壳聚糖结合起来进行果蔬保鲜研究的，如Panayiota等[16]的研究发现，墨角兰精油与壳聚糖结合使用可以降低鲜切莴苣在冷藏过程中的酵母与霉菌数。将壳聚糖与植物精油复合涂膜用于采后板栗的保鲜，尚未见相关研究报道。本实验以湘栗四号板栗为试材，在预实验的基础上，将不同植物精油复合，结合壳聚糖涂膜处理板栗，研究其对板栗采后石灰化、霉变腐烂及生理生化的影响，以期为板栗的采后保鲜提供新的技术路径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山苍子、肉桂、牛至、迷迭香 购于青岛和本食品配料有限公司；山苍子、肉桂、牛至和迷迭香精油

实验室自制；湘栗四号板栗 采自湖南常德市，在板栗基地选取无机械损伤和病虫害、成熟度一致（九成熟）的果实，采后立即运回实验室，在0～4 ℃下预冷24 h后备用；壳聚糖（食品级，脱乙酰度＞92%）、抗坏血酸、2,6-二氯酚靛酚 上海国药集团。

R4i型台式高速冷冻离心机 法国Jouan公司；AL240型精密电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；Lamda-25紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；JY92-11超声细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；JB挥发油提取器常州普天仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 植物精油的提取及板栗的处理 在实验室采用超声辅助水蒸气蒸馏法提取植物精油，方法如下：将山苍子、肉桂、牛至和迷迭香按质量添加2倍（v/m）蒸馏水，用高速组织捣碎机设7000 r/min处理12 min，然后用超声细胞粉碎机处理，功率为300 w，料液比为1:9（m/v），时间为30 min，最后用JB挥发油提取器水蒸气蒸馏6.0 h，得到山苍子、肉桂、牛至和迷迭香精油。

板栗的处理：制备1.5%（w/v）的壳聚糖涂膜液备用，其浓度依据预试验结果并参考文献[5]。在预实验的基础上，将山苍子精油、肉桂精油、牛至、迷迭香精油按1:1:1:1（v/v）配制成复合精油备用。对照：板栗用超纯水浸泡1 min后，捞出晾干。壳聚糖涂膜处理（处理1）：用1.5%的壳聚糖涂膜液浸泡板栗1 min后，捞出晾干。复合植物精油处理（处理2）：将45.0 g/L的聚氧乙烯蓖麻油30（Cremophor EL30）溶液与无水乙醇按1:2（v/v）制成复合表面活性剂，将前述复合表面活性剂、上述复合植物精油与超纯水按照1:1:98（v/v/v）混匀后，用其浸泡板栗1 min，捞出晾干。复合植物精油处理结合壳聚糖涂膜（处理3）：在处理2的基础上，再进行壳聚糖涂膜处理，方法同处理1。对照和3个处理的板栗用量约为10 kg，均设3次重复，用塑料网兜盛装后放在搁物架上，置于（0±1）℃、RH85%～90%的环境下贮藏，而用于害虫防控效果试验的板栗则在室温条件下（温湿度不恒定，未记录）贮藏75 d。

1.2.2 指标的测定

1.2.2.1 贮藏过程中板栗失重率的测定 采用称重法，每30 d取样一次，取样量为500 g。

失重率（%）=[板栗初始质量（g）-测定时质量（g）]/板栗初始质量（g）×100

1.2.2.2 贮藏过程中板栗霉变率、虫果率及具商品价值的好果率的测定 霉变率测定每30 d取样一次，虫果率测定每15 d取样一次，每次随机取50粒板栗，剥掉栗壳及包衣，将栗仁对半切分后观察，统计霉变、长虫的板栗果数量。

霉变率（%）=霉变果数/取样总果数×100

虫果率（%）=长虫果数/取样总果数×100

贮藏至第150 d时，随机取50粒板栗，剥掉栗壳及包膜，将栗仁对半切分后观察，统计好果的数量，好果定义为无霉变、无虫害、无异味的具有商品价值板栗果。

好果率（%）=好果数/取样总果数×100

1.2.2.3 贮藏过程中板栗石灰化指数的测定 参考宋雯雯[17]的方法。每30 d取样一次。随机取50粒板栗从中间切开，计算其石灰化指数。石灰化指数计算依板栗仁石灰化面积划分级别，无变化的为0级，＜20%为1级，20%～50%为2级，＞50%为3级。

石灰化指数=Σ（石灰化级别×该级果数）/（石灰化最高级别×总果数）×100

1.2.2.4 贮藏过程中板栗淀粉、VC含量的测定 板栗仁淀粉含量的测定：参照曹建康等[18]的方法，用酸水解法，每30 d取样一次。取1.000 g板栗仁样品，用80%乙醇水浴去可溶性糖，加蒸馏水煮沸糊化后用9.2 mol/L高氯酸提取，用3,5-二硝基水杨酸显色，在540 nm波长下测吸光度后换算，以质量分数（%）表示。板栗仁VC含量的测定：采用2,6-二氯靛酚法，结果以每100 g板栗仁所含抗坏血酸毫克数表示[19]。

1.2.2.5 贮藏过程中板栗CAT、SOD活性的测定及MDA含量的测定 参考曹建康等[18]的方法。每30 d取样一次。CAT活性测定采用分光光度法，取5.000 g板栗仁，研碎后用缓冲液提取、离心，得酶提取液，酶促反应体系由2.9 mL浓度为20 mmol/L H2O2和100 μL酶提取液组成，在240 nm处测吸光度，每30 s记录一次，以每分钟吸光度减少0.01为1个酶活力单位（U），酶活性单位表示为U/mg。SOD活性测定用氮蓝四唑（NBT）光还原法，取5.000 g板栗仁，获得酶提取液的方法基本同CAT测定，将酶提取液、缓冲液、750 μmol/L NBT、20 μmol/L核黄素等混合，在560 nm处测定吸光度，以每分钟每克样品的反应体系对NBT光还原的抑制为50%定义为1个SOD活力单位（U），酶活性单位表示为U/g。MDA含量的测定用硫代巴比妥酸（TBA）法，取1.000 g样品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸后研磨、离心，得上清液，取2.0 mL上清液，加入同体积的0.67%TBA后煮沸，冷却后离心，分别在450、532和600 nm处测定吸光度，反应液中MDA的浓度c（mmol/L）=[6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450]÷1000，单位表示为mmol/g。

1.3 数据分析

所有指标的测定均重复3次，结果取平均值。采用SPSS 17.0进行数据处理分析，用邓肯多重比较方法进行差异显著性检验，0.05为显著水平，0.01为极显著水平。

2 结果与分析

2.1 复合植物精油处理结合壳聚糖涂膜对板栗失重率的影响

采后板栗的失水与呼吸消耗是导致其失重的主要原因。贮藏期间板栗失重率的变化见图1。由图1可见，在整个贮藏过程中，对照组和各处理组的板栗失重率均呈上升趋势，但对照组的失重率在第30 d时显著高于3个处理组（P＜0.05），在第60 d及以后极显著高于3个处理组（P＜0.01），说明壳聚糖涂膜对降低板栗重量损失具有极好的效果，而植物精油处理的效果虽不及壳聚糖涂膜，但仍展示了良好的作用，壳聚糖涂膜及精油处理后在板栗壳表面形成一层膜，其对板栗有两重效应，一是减少水分蒸腾散逸，二是降低呼吸强度，故能够一定程度抑制板栗失重率的上升。3个处理中，处理1与处理3在贮藏的前120 d的差异不显著（P＞0.05），第150 d时存在显著差异（P＜0.05）；而处理2与处理1、3之间在第30 d和第60 d的差异不显著（P＞0.05），至第90 d存在显著差异，并延续至贮藏结束（P＜0.05）。至第150 d时，处理3、处理1和处理2的失重率分别为2.9%、3.1%和3.6%，而对照则高达11.9%。Luana等[20]的研究也发现，壳聚糖涂膜对锥栗失重具有很好可见，采用复合植物精油处理结合1.5%壳聚糖涂膜是采后板栗控制失重的适宜方式。

图1 贮藏过程中板栗失重率的变化Fig.1 Changes of weight-loss rate of chestnuts during storage

2.2 复合植物精油处理结合壳聚糖涂膜对板栗霉变、虫害及好果率的影响

贮藏过程中板栗霉变率与虫果率的变化分别见图2和图3。由图2可见，贮藏期间，对照组和各处理组的板栗霉变率均呈上升趋势，但对照组的霉变率上升速度很快，在第30 d即极显著高于3个处理组（P＜0.01），至贮藏结束时的霉变率达22.8%。而3个处理组虽然霉变率也在不断升高，但幅度较对照组明显要低，尤其是处理3，从第30 d至贮藏结束，其防霉效果均好于处理1和处理2（P＜0.05）。在第30和第60 d，处理2的霉变率均低于处理1（P＜0.05），但到第90 d，二者差异不明显，这一趋势维持至贮藏结束，这提示仅仅采用复合精油处理板栗，对贮藏前期的板栗防霉具有良好的效果，但随着精油的不断挥发，其防霉作用快速下降。壳聚糖涂膜具有抑制板栗霉变的效果，Luana等[20]将壳聚糖用于锥栗的涂膜保鲜，Huang等[21]将壳聚糖与乳清蛋白复合用于板栗涂膜保鲜，也发现了其良好的防霉作用，这与本文的研究结果有相似之处。而壳聚糖涂膜与复合精油处理结合起来的防霉效果则进一步提示，壳聚糖成膜后对植物精油的裹覆作用，降低了后者的挥发性，有利于其防霉作用的持续发挥。

图2 贮藏过程中板栗霉变率的变化Fig.2 Changes of molding rate of chestnuts during storage

图3 贮藏过程中板栗虫果率的变化Fig.3 Changes of pest rate of chestnuts during storage

由图3可见，贮藏期间板栗虫果率与霉变率的变化规律有很大不同，仅仅采用壳聚糖涂膜对防虫没有效果，在整个贮藏期间该处理与对照没有显著差异（P＞0.05），而处理2在第15、30 d都与处理3无明显差异（P＞0.05），但在第45 d后差异显现（P＜0.05），说明精油挥发殆尽，已丧失对虫卵的抑制作用。而处理3则对抑制板栗中虫卵生长具有极佳的效果，至第75 d，虫果率仅为0.8%，在整个贮藏期间均维持在一个很低的水平。而本文的研究表明，复合植物精油具有防控采后板栗害虫的良好作用，将植物精油处理与壳聚糖涂膜结合用于采后板栗虫害防控实为可取的技术手段。

贮藏至第150 d时好果率测定结果见表1。表1的结果显示，对照组的好果率明显低于3个处理组，差异极显著（P＜0.01）；而各处理组之间，处理3的好果率最高，平均值达到93%，处理1次之，处理2最低，三者之间存在显著差异（P＜0.05），说明植物精油处理和壳聚糖涂膜处理均可显著减缓采后板栗商品价值劣变的进程，值得一提的是，二者结合使用具有叠加效应。

表1 贮藏至第150 d时的好果率Table 1 Rate of chestnuts with commercial quality on 150th day

2.3 复合植物精油处理结合壳聚糖涂膜对板栗淀粉含量与石灰化的影响

贮藏过程中板栗淀粉含量与石灰化指数的测定结果分别见图4和图5。由图4可见，贮藏期间随着板栗淀粉水解转化为可溶性糖，对照组和各处理组的淀粉含量均呈下降趋势，但对照下降速度明显要快。第30 d时，对照与3个处理组即存在差异显著（P＜0.05），而3个处理组间则无明显差异（P＞0.05）。第60 d时，3个处理组间仍无显著差异（P＞0.05）。第90 d及120 d时，三者的差异达到显著水平（P＜0.05）。至第150 d时，处理3的淀粉含量仍为42.0%，仅较贮藏初始时下降7.7%，而处理1和处理2分别下降了14.1%和21.8%，处理3与处理1的差异显著（P＜0.05），处理3与处理2的差异极显著（P＜0.01）。这一结果说明，壳聚糖涂膜对抑制板栗呼吸酶系统的活性具有良好的作用，而植物精油也有一定的效果，二者结合使用的效果显著。

图4 贮藏过程中板栗淀粉含量的变化Fig.4 Changes of starch contents of chestnuts during storage

图5 贮藏过程中板栗石灰化指数的变化Fig.5 Changes of calcification degrees of chestnuts during storage

贮藏过程中板栗石灰化指数的测定结果见图5。由图5可见，随着贮藏时间的延长，即使在（0±1）℃、RH85%～90%下，对照组的石灰化率仍呈持续快速上升的趋势，至150 d时达11.2%，对照组的石灰化率在整个贮藏期间始终高于各处理组，差异极显著（P＜0.01）。3个处理组之间，在整个贮藏期，处理3的石灰化程度最低，处理1次之，处理2最高，每个测定时间点测定值的差异均达到显著水平（P＜0.05）；至第150 d时，处理3的石灰化指数仅为3.0%。复合植物精油处理结合壳聚糖涂膜对采后板栗石灰化的影响与板栗淀粉含量的变化规律相同，说明板栗的石灰化程度与淀粉含量的下降高度相关。板栗贮藏过程中因失水而刺激淀粉酶活性增强，导致淀粉因不断分解而减少，引起淀粉晶体结构及理化性能的改变，这是导致板栗石灰化的关键诱因，与淀粉水解后产生的蔗糖含量无关[3]。顾采琴等[22]的研究认为，高湿环境能有效抑制板栗石灰化的发生。本文的研究结果也提示，减少采后板栗蒸腾失水的技术手段可一定程度抑制其石灰化的发生。但也有研究认为，除了失水，细胞壁的破坏也是引起板栗石灰化的主要原因[23]。

2.4 复合植物精油处理结合壳聚糖涂膜对板栗仁VC含量的影响

贮藏过程中板栗VC含量的变化见图6。由图6可见，对照组与各处理组的VC含量在贮藏期间逐渐降低，对照的下降速度比各处理组要快，但在第30 d，差异不明显（P＞0.05）。第60 d至试验结束，对照组与各处理组之间均存在显著差异（P＜0.05）。而3个处理组间，在第30、60 d时无差异（P＞0.05），第90 d时，处理1和处理2间无差异（P＞0.05），但处理3的VC含量则高于前两者（P＜0.05），第120和150 d时，3个处理组间均存在差异（P＜0.05）。第150 d时，处理3的VC含量比初始时下降11.9%，而处理1为18.2%、处理2为25.0%。可见，植物精油处理结合壳聚糖涂膜，有利于抑制采后板栗VC的损失，其原因可能在于植物精油的抗氧化作用而减少了VC的氧化损失。Muzafary等[24]也发现，将壳聚糖与柠檬草精油或丁香精油结合处理柑橘，可有效减少其贮藏过程中VC的损失，这与本文的研究结果有相似之处。

图6 贮藏过程中板栗仁Vc含量的变化Fig.6 Changes of Vc contents of chestnuts during storage

2.5 复合植物精油处理结合壳聚糖涂膜对板栗仁CAT、SOD活性及MDA含量的影响

贮藏过程中板栗仁CAT和SOD活性的变化分别见图7、图8。由图7可见，贮藏期间板栗的CAT活性呈逐渐下降趋势，与各处理组相比，对照组的下降速度最快，在第30 d时即显著低于各处理组（P＜0.05），至第150 d时差异达到极显著水平（P＜0.01）。不同处理组的结果显示，植物精油处理与壳聚糖涂膜均具有一定的抑制CAT活性下降的作用，二者结合使用具有一定的叠加效应，3个处理组间在第30和60 d的差异不明显（P＞0.05），第90 d时处理1与处理2之间仍无差异（P＞0.05），但处理2与处理3之间已有显著差异（P＜0.05），第120 d和150 d时3个处理之间均存在显著差异（P＜0.05）。

图7 贮藏过程中板栗仁CAT活性的变化Fig.7 Changes of the activity of catalase of chestnuts during storage

图8 贮藏过程中板栗仁SOD活性的变化Fig.8 Changes of the activity of superoxide dismutase of chestnuts during storage

SOD是植物体中专一清除超氧阴离子自由基的金属蛋白酶。图8显示了采后板栗SOD活性与CAT活性基本一致的变化趋势。这一结果提示，植物精油处理与壳聚糖涂膜能维持采后板栗的SOD与CAT在一个较高的活性水平，进而维持了其较强的抗氧化能力。

贮藏过程中板栗MDA的变化情况见图9。由图9可见，MDA的变化趋势与CAT和SOD活性变化趋势则刚好相反，其原因在于后两者一直维持较高的活性，故MDA的积累就少。徐鑫等[25]采用壳聚糖结合艾叶与石榴皮提取物对板栗进行涂膜保鲜处理，也发现该处理能显著降低MDA的积累。本文的研究结果证实，对中长期贮藏来说，植物精油处理结合壳聚糖涂膜有利于维持板栗在贮藏中后期较强的抗氧化能力，能有效降低膜脂过氧化程度，有利于维持板栗的商品品质。江敏等[26]用壳聚糖-纳米氧化锌复合涂膜砂糖橘，周汉军等[27]用桉叶精油处理砂糖橘，发现都能一定程度抑制砂糖橘SOD活性的下降，这与本文的研究结果有相似之处。本文将植物精油处理和壳聚糖涂膜用于板栗的保鲜，尤其是将二者结合起来使用，可有效减少水分的蒸腾散逸，维持板栗壳内板栗仁所处微空间内较高的相对湿度，这也从另一侧面证实了顾采琴等[22]得出的高相对湿度（90%）比低相对湿度（50%）更有利于维持板栗CAT和SOD活性、减少MDA积累的结论。

3 结论

1.5%壳聚糖涂膜对采后板栗保鲜的主要作用在于减少失水、抑制呼吸与石灰化，有一定的防霉效果，但作用有限。山苍子精油、肉桂精油、牛至精油和迷迭香精油按1:1:1:1（v/v）的复合植物精油处理对采后板栗的防霉、防虫与活性氧代谢调控的效果俱佳，但单独使用易挥发，保鲜作用的持续性不好。而将复合植物精油浸果处理后再以壳聚糖涂膜，不仅后者可减缓前者的挥发，更重要的是二者可以做到优势互补，能有效减少贮藏过程中板栗的失重、抑制霉变与虫害、减缓VC的消耗，能维持CAT与SOD的活性，抑制MDA的积累，且能有效抑制石灰化的进程，对采后板栗的保鲜效果最佳，是一种极富前景的板栗采后保鲜技术手段。采后板栗石灰化产生的机制非常复杂，本文的研究也再次证实文献已报道的失水及淀粉水解程度与石灰化程度的高度关联性，但其具体分子机制仍不清楚，未来可借助代谢组学的方法对其展开系统性研究。