麋鹿血液生理生化指标的性别及年龄差异

袁红平 王立波 郜志鹏 俞晓鹏 解生彬*

(1.盐城市麋鹿研究所，盐城，224136；2.江苏省大丰麋鹿国家级自然保护区管理处，盐城，224136)

血液生理、生化指标能客观反映动物机体的生理性变化，通过对血液生理生化指标的测定能认识动物的生命活动规律，其变化与机体的生理或病变相关性极高。动物血液生理生化指标的研究对种群科学管理十分重要，而血液生理生化指标监测方法因具有操作简便、损伤较小、判读容易等优点，被广泛应用于动物疾病临床诊断和治疗[1]。近年来对有蹄类(Artiodactyla)动物的血液生理生化指标研究开展很多，如林麝(Moschusberezovskii)、梅花鹿(Cervusnippon)、重庆地区圈养白唇鹿(Przewalskiumalbirostris)、牦牛(Bosgrunniens)、圈养毛冠鹿(Elaphoduscephalophus)、豚鹿(Axisporcinus)等[2-7]；除了有蹄类动物外，圈养金钱豹(Pantherapardus)、会理黑山羊(Capraaegagrushircus)、圈养山魈(Mandrillussphinx)等也有相关研究[8-10]。这些血液生理生化的研究对动物临床疾病检测、治疗保护、饲养管理和营养生态学等研究都具有显著指导意义。

麋鹿(Elaphurusdavidianus)是原产于中国的特有珍稀濒危物种，属于国家一级保护野生动物[11]。1865年，法国传教士阿芒·大卫第1次科学性的发现这一奇特的动物，并命名为Père David’s deer。目前，我国已有麋鹿迁地保护场所50多处，总数8 000多头，是重引入物种的一个典范。国内外对麋鹿的研究成果丰硕：宏观研究方面包括种群动态、发情期昼间活动时间分配、行为谱、濒危机制、交配计策、生境与行为、栖息地退化、记忆、灭绝风险、潜在生境评价、种群结构等[12-13]；微观研究方面包括遗传多样性、组织解剖学、细胞生物学、疾病诊治和生理生化等[14]。

麋鹿的血液生理生化相关研究国外起步较早，Beck等报道了美国多个人工饲养麋鹿的血液生理生化指标[15]。国内学者以北京南海子麋鹿苑个体为样本测定麋鹿的生理代谢、免疫、肝功能等指标，分析健康麋鹿自由基代谢水平，探索麋鹿的健康评价体系并建立生理生化指标正常值参考范围[16-21]。但由于地理位置、环境、食物来源、放养模式等差异，不同地域麋鹿的血液指标可能具有一定差异性。尽管前人以大丰麋鹿个体为样本开展过粪样激素水平、血液生理生化、不同性别和季节血浆性激素水平的测定[22-24]，但由于麋鹿种群数量的持续增加、活动范围的扩大、日粮结构的变化等，进一步开展大丰麋鹿种群血清生理、生化及性激素水平研究，对麋鹿的适应能力、繁殖能力、疾病的诊断治疗以及保护、管理模式具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为江苏省大丰麋鹿保护区的健康麋鹿，共119头，其中雄性麋鹿64头(幼鹿7头、亚成体17头、成体40头)，雌性麋鹿55头(幼鹿6头、亚成体11头、成体38头)。参照《简明养鹿手册》[25]，结合实际观测，麋鹿年龄结构的划分标准为：断奶至1岁为幼体，1.0—3.5岁为亚成体，3.5岁以上为成体。选取的幼鹿种群为2019年4月出生的个体，均为2月龄，模拟野外母鹿以牛乳和牧草相结合方式喂养。亚成体为2018年4月出生的个体，均为14月龄，以青贮饲料和配合饲料喂养。成体麋鹿选取第一、第二、第三放养区的麋鹿，以毛色、角型、牙齿和是否仔鹿跟随来判定发育状态。

1.2 方法

1.2.1 血液采集

春、秋和冬季在09：00，夏季在08：00，利用吹管法注射鹿眠灵(2.0 mL)对测试麋鹿进行麻醉保定，待其完全进入麻醉状态后，用添加抗凝素的专用真空采血管颈静脉采集血液，每只采集3管，每管5 mL，其中1支为EDTA负压采血管，2支为加有促凝剂的促凝管。EDTA负压采血管血样温和颠倒混匀4—5次后，4℃保存待用；促凝管血样室温静置30 min后，3 500 r/min离心10 min待用。采血后每头麋鹿肌肉注射鹿醒灵4 mL催醒。

1.2.2 仪器及检测方法

鹿眠宁、鹿醒灵，由吉林省华牧动物保健品有限公司生产。血样采集后立即送往大丰和盐城市妇幼保健院血液检验中心。

血液生理指标用优利特2900VetPlus全自动血细胞分析仪(COULTER ACT diff2TM)测定白细胞总数(WBC)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白质量(MCH)、平均血红蛋白质量浓度(MCHC)、红细胞分布宽度变异系数(RDW-CV)、红细胞分布宽度标准差(RDW-SD)、血小板总数(PLT)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)等指标。

血液生化指标采用优利特8036全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、尿素(UREA)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL)、葡萄糖(GLU)、球蛋白(GLB)等生化指标；采用优利特910A电解质分析仪(离子选择性电极法)测定钾(K+)、钠(Na+)、氯(Cl-)、离子钙(Ca2+)指标。

1.2.3 数据分析

用Excel 2007、SPSS 21.1进行统计分析，计算平均值、标准差及变异系数。所有数据先做单一样本K-S检验(One-Sample Kolmogor-Smirnov test)数据的正态性，对符合正态分布以Independent-Sample test检验，否则以Mann-WhitneyU检验各检测指标的差异，以单因素方差分析(one-way ANOVA)分析进行不同年龄结构和不同饲养模式指标的两两比较，P<0.05差异显著，P<0.0l差异极显著。

2 结果与分析

2.1 麋鹿血液生理指标的性别差异

血液生理常规测定结果显示：雄性麋鹿在红细胞指标、中性粒细胞指标、血红蛋白指标和血小板总数上高于雌性，而雌性麋鹿淋巴细胞指标和平均血红蛋白质量浓度高于雄性，经Mann-WhitneyU检验差异显著(P<0.05)，其他指标差异不显著(P>0.05)(表1)。

续表1

2.2 麋鹿血液生化指标的性别差异

雌雄麋鹿生化指标常规测定结果(表2)显示：雄性碱性磷酸酶和葡萄糖指标高于雌性，尿酸、尿素、胆固醇和甘油三酯指标低于雌性，经Mann-WhitneyU检验差异显著(P<0.05)，其他指标差异不显著(P>0.05)。

2.3 麋鹿血液生理指标的年龄差异

由表3可见，不同年龄结构雌性麋鹿生理指标的测定结果显示：幼体与亚成体淋巴细胞比率、中间细胞总数、中间细胞比率、红细胞压积和红细胞分布宽度变异系数指标差异显著(P<0.05)，中性粒细胞比率、红细胞总数、平均血红蛋白质量、平均血红蛋白质量浓度、血小板总数和血小板压积指标差异极显著(P<0.01)；幼体与成体在白细胞总数、平均血红蛋白质量浓度、血小板总数、血小板压积指标上差异显著(P<0.05)，淋巴细胞比率、淋巴细胞总数和中性粒细胞比率指标差异极显著(P<0.01)；亚成体与成体在中间细胞比率、红细胞总数、血红蛋白和红细胞压积指标上差异显著(P<0.05)，其他指标差异不显著(P>0.05)(表3)。对雌性麋鹿的19项生理指标检测结果中，幼体雌性麋鹿白细胞、红细胞、血小板等12项指标显著高于亚成体和成体，说明幼体麋鹿的器官发育还不完善，免疫力较差。

不同年龄结构雄性麋鹿生理指标的测定结果(表3)显示：幼体与亚成体淋巴细胞总数、红细胞平均体积、平均血红蛋白质量、血小板平均体积指标差异显著(P<0.05)，白细胞总数、中间细胞总数、红细胞总数、血小板总数、血小板压积指标差异极显著(P<0.01)；幼体与成体中间细胞比率、红细胞分布宽度标准差指标差异显著(P<0.05)，白细胞总数、淋巴细胞比率、中性粒细胞比率、淋巴细胞总数、中间细胞总数、红细胞平均体积、平均血红蛋白质量、血小板总数、血小板平均体积和血小板压积指标差异极显著(P<0.01)；亚成体与成体中性粒细胞比率、红细胞平均体积、平均血红蛋白质量差异显著(P<0.05)，淋巴细胞比率、淋巴细胞总数、红细胞压积指标差异极显著(P<0.01)。对雄性麋鹿的19项生理指标检测结果显示，幼体雄性麋鹿白细胞、红细胞、血小板总数等14项指标幼体显著高于亚成体和成体，与不同年龄结构雌性麋鹿血液生理指标的检测结果一致。

表3 不同年龄结构麋鹿血液生理指标差异(one-way ANOVA)Tab.3 Analysis of blood physiology index of Père David’s deer with different ages structure(one-way ANOVA)

2.4 麋鹿血液生化指标的年龄差异

不同年龄结构雌性麋鹿生化指标的测定结果(表4)显示：幼体-亚成体麋鹿的总蛋白、白蛋白、总胆红素和钾离子指标差异极显著(P<0.01)；亚成体-成体麋鹿的天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶指标差异显著(P<0.05)，总蛋白、尿酸和离子钙差异极显著(P<0.01)；而幼体-成体麋鹿的天门冬氨酸氨基转移酶、血清总蛋白、白蛋白、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、尿酸、胆固醇、球蛋白、钾离子、离子钙多项指标差异性极显著(P<0.01)。对雌性麋鹿19项生化指标的检测结果显示，幼体雌麋鹿蛋白、肾功能指标显著低于亚成体和成体；胆红素、酶类显著高于亚成体和成体，主要由于幼鹿肝肾等多功能还不够完善。

根据对不同年龄结构雄性麋鹿生化指标的测定结果(表4)显示：幼体-亚成体麋鹿的碱性磷酸酶、肌酐、胆固醇和氯离子差异显著(P<0.05)，血清总蛋白、白蛋白差异极显著(P<0.01)；亚成体-成体麋鹿的尿素、肌酐、葡萄糖和离子钙差异性极显著(P<0.01)；而幼体-成体麋鹿的丙氨酸氨基转移酶、尿酸、葡萄糖和氯离子差异显著(P<0.05)，血清总蛋白、白蛋白、直接胆红素、碱性磷酸酶、尿素、肌酐、胆固醇、球蛋白和离子钙差异性极显著(P<0.01)。对雄性麋鹿19项生化指标的检测结果显示，幼体雄性麋鹿肝功能指标高于亚成体和成体，肾功能指标低于亚成体和成体，与不同年龄结构雌性麋鹿生化指标的研究结果一致。

表4 不同年龄结构麋鹿血液生化指标差异(one-way ANOVA)Tab.4 Analysis of blood biochemical indexes of Père David’s deer with different ages (one-way ANOVA)

3 讨论

3.1 性别对麋鹿血液生理生化指标的影响

由麋鹿个体间血液生理指标分析结果可知，大部分数值的变异系数较小，说明麋鹿血液生理指标相对稳定，变异系数较大的指标主要是白细胞、淋巴细胞、中间细胞和中性粒细胞，推测是由于不同个体对外界环境刺激的应答差异。血小板和红细胞相关指标在雌雄麋鹿间有显著差异，但表现出显著的雄性高于雌性，与钟震宇等[16]和孙大明等[22]的研究结果一致，初步推测雄雌指标高低具有一定规律性。参照北京南海子麋鹿苑健康麋鹿血液生理生化指标，白细胞数量、红细胞数量和血小板数量指标均偏低[21]，不在参考值范围内的9项指标也与钟震宇等[16]对南海子麋鹿苑麋鹿血液生理生化指标范围的测定结果基本相吻合，但是测定结果和对大丰麋鹿种群的报道[22]有差异，这可能是因为麋鹿血液生理生化指标值与麋鹿的饲养方式、营养状况、遗传变异、应激情况等有一定关系。曾有报道大丰麋鹿种群贫血麋鹿的血液生理生化值，除嗜中性白细胞指标值高于正常指标值外，其他指标远低于正常指标值[26]。本研究表明，大丰麋鹿保护区的麋鹿通过人工补饲，营养状况有了显著改善，通过血红蛋白的指标值可以看出不存在贫血的现象，说明麋鹿健康状况良好，能够增加麋鹿的代谢水平和免疫能力，提高抵抗力。

由麋鹿血液生化指标分析结果可知，19项检测指标中有10项表现出雄性高于雌性，有12项指标雄雌高低差异与前人对南海子麋鹿苑麋鹿的研究[20]一致，有12项指标的变异系数超过了20%，与钟震宇等[16]研究结果吻合，说明这些指标在血液中的含量很不稳定。碱性磷酸酶主要来自骨骼，由成骨细胞产生，碱性磷酸酶的活力是机体的骨代谢率与成骨作用的程度，研究结果显示雄性显著高于雌性，这可能与雄性第二性征鹿角的生长有关。血液中甘油三酯和胆固醇的指标值是体内脂肪利用情况的反应，甘油三酯越低说明个体对脂肪的利用程度越高，而且胆固醇还是合成肾上腺皮质激素和性激素的重要原料，研究结果显示雄性显著低于雌性，推测与雄麋鹿的活动量和性行为有关。而雄性麋鹿的葡萄糖指标显著低于雌性，可能与麋鹿的采食、体型有关。本研究测定结果部分指标与白唇鹿、毛冠鹿等鹿科(Cervidae)动物吻合度较高[4，6]，这可能由于同属于食草动物。本研究结果中，尿酸指标值与南海子麋鹿种群血液生化指标的检测相比差异显著，与前人对大丰麋鹿种群的报道基本一致，说明大丰麋鹿种群生境中水、植被等含盐量仍然较高[21-22]。本研究显示，大丰麋鹿种群胆红素指标显著高于前人研究，但其他肝胆功能指标与前人研究基本吻合，说明麋鹿的肝胆功能未有显著损伤，至于偏高原因有待进一步探究。

3.2 年龄对麋鹿血液生理生化指标的影响

对不同年龄结构雌性和雄性麋鹿生理指标的分析表明，幼体与亚成体、幼体与成体白细胞总数及分类指标、血红蛋白质量和质量浓度及血小板有关指标存在显著差异，而且幼体的指标较高，可能跟幼体免疫力、抗病能力较低有关，需要增加与免疫有关的生理指标来抵御外界环境的变化。不同年龄结构雌雄麋鹿生化指标分析表明，幼体与成体多数指标存在显著差异。血清中天门冬氨酸和谷丙氨酸在心脏和肝脏中的活性最高，常用于肝脏和心脏功能好坏的评价指标。总胆红素、直接胆红素广泛用于肝胆疾病及溶血性疾病的诊断，胆红素测定一直作为一项重要的常规肝功能指标广泛用于临床。肌酐是肌肉在动物体内代谢的产物[27]，尿素、尿酸取决于食物中氮含量与肾功能的状态，反映的都是肾脏的功能状态。Na+主要作用是维持血浆和组织间液等细胞外液的渗透压，调节酸碱度；K+有维持细胞内液的渗透压，参与细胞内糖、蛋白质和能量代谢，维持心肌的功能；Cl-参与细胞外液渗透压的调节、内液酸碱平衡的调节；Ca2+参与骨骼的构建[5]。幼体麋鹿天门冬氨酸、胆红素指标、肌酐、尿酸、尿素显著高于成体，可能与幼体肝肾功能还不完善有关。而幼体麋鹿Ca离子显著低于成体，可能与幼体骨骼生长所需Ca总量较多有关。总蛋白高低可以反映出肝、肾和机体代谢功能是否正常，在机体内的含量不同阶段经常变化，球蛋白也是重要的免疫指标，能反应机体的抗病能力[9]。总蛋白是白蛋白和球蛋白的总称，也由肝脏合成，具有维持血浆正常胶体渗透压和pH值、运输脂肪酸和胆红素等作用的一类小分子蛋白质[28-29]。幼体总蛋白、白蛋白和球蛋白指标显著低于成体，说明幼体麋鹿的脏器发育不完善，抵抗力较差。碱性磷酸酶是一种磷酸单脂酶，在肝脏、骨骼、肠和肾等重要组织器官均有分布，其在血液中的含量与骨骼发育存在关联[12]。幼体血液中碱性磷酸酶显著高于成体，幼体碱性磷酸酶主要来源于骨骼，随着麋鹿长大成熟、骨骼成年化，骨骼中碱性磷酸酶会逐渐减少。所以，以碱性磷酸酶指标值作为麋鹿疾病诊断的参考时，一定要结合麋鹿年龄以及其他指标值。血清中Na、K、Ca等离子具有共同维持神经肌肉和某些组织器官正常兴奋性的作用，尤其Ca离子还是判断骨细胞活性的重要指标。而电解质的指标值能直接评价麋鹿日粮的适合程度和麋鹿的代谢水平，结果表明年龄结构对麋鹿电解质的影响主要体现在Ca离子，而Na+、K+在各年龄段麋鹿体内都处于平衡状态。