沉积物氮模拟释放过程中氨氧化菌群落变化

刘卓，杨代琼，李姣，陆莹，卢昶雨

(1.河北地质大学 实验实践教学中心，河北 石家庄 050031；2.河北地质大学 水资源与环境学院 河北省水资源可持续利用与开发重点实验室 河北省水资源可持续利用与产业结构优化协同创新中心，河北 石家庄 050031；3.西安市市政设施管理中心，陕西 西安 710016；4.复旦大学 环境科学与工程系，上海 200433)

近年来，国内湖泊面临着水质逐年恶化、富营养化日益严重等问题，除了磷之外，氮也是限制湖泊富营养化的主要因子[1]。当湖泊水体氮负荷较重时，部分形态氮会通过沉淀或者由颗粒物吸附而蓄存于沉积物中，使沉积物成为湖泊水体污染物的重要蓄积库[2-6]。

针对湖泊沉积物界面氮交换通量问题的研究方法有质量衡算法、孔隙水扩散模型、表层沉积物模拟法、柱状芯样模拟法和水下原位模拟法[7]。各类方法对沉积物氮释放通量的研究主要集中于营养盐释放通量流动培养[8]、释放通量的估算[9]、释放通量影响因素等[10]。其大部分均是针对沉积物-水界面氮释放通量的单独研究，氮释放通量对微生物群落结构间的影响则相对较少。沉积物-水界面微生物群落中硝化细菌的群落结构与各形态氮释放通量有着密切的关系，氨氧化细菌(AOB)是硝化细菌中最主要的细菌之一，其可将氨氮转化为亚硝酸盐，使得亚硝酸盐继续转化为硝酸盐[11-13]。

滇池海埂地区位于滇池草海和外海交界处，成为了滇池的一处蓝藻聚集带，污染相对较为严重。截止到采样时间，整个区域被两层围隔围成面积为0.5 km2的封闭区域。本研究通过对海埂地区沉积物氮释放的模拟，研究氮释放过程中释放通量对沉积物-水界面氨氧化菌群落结构的影响，以期为研究及控制海埂地区水体富营养化提供基础数据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

水样、底泥、沉积物均取自滇池海埂；去离子水。

3 L有机玻璃水样采集器；PSC-1/40彼得森挖泥器；Mobio Powersoil Isolation Kit试剂盒(100次/盒)；Applied Biosystems PCR扩增器；sds-page变性梯度凝胶电泳(DGGE)；S4 EXPLORER X-射线荧光分析仪。

1.2 样品采集

对海埂区域内4个具有代表性的点位(见图1)进行样品采集，#1为技术集成示范区(湖泊内源污染控制技术集成区域)，仅进行了短时间的蓝藻清除工作；#2为风浪较大区域；#3情况较为复杂，水深达3.5 m，位于两层围隔的航道之间，最外层围隔并未把整个研究区围成封闭式区域，因此#3的水体与外海水体之间有水质交换；#4为水位最深处，水深达4 m。

图1 采样点分布示意图Fig.1 Position of sampling sites

采用3 L有机玻璃水样采集器采集水样，采水器内置温度计，可现场读出水温，水样均在24 h内带回实验室进行分析。底泥使用彼得森挖泥器进行采集，每个点位进行多次采泥，每次采集表层底泥4～6 L，放入干净盆中混匀，装入保温箱中，24 h内带回实验室进行模拟实验。

1.3 实验设计

采用有机玻璃柱进行沉积物氮释放通量的模拟实验。有机玻璃柱下端封闭，上端带有密封盖子，沉积物(高度5 cm)灌入有机玻璃柱以后，通过虹吸法(防止底泥扰动)将去离子水缓慢注入有机玻璃柱，高度20 cm。实验4个点位沉积物释放模拟反应器分别放入恒温培养箱。实验开始后，每天采样1次，每次采样位置为水面下10 cm处，每次采完水样，立即向玻璃柱中注入等量的去离子水；同时，采取模拟反应器表层沉积物样品2～5 g，用于沉积物DNA提取。实验持续41 d，每组实验均设置3组平行。

1.4 实验方法

1.4.1 DNA提取 根据Mobio Powersoil Isolation Kit试剂盒的操作说明，对沉积物样本进行基因组DNA抽提。

1.4.2 PCR扩增 AOB的PCR扩增采用引物为CTO189fAB-GC(CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGAGRAAAGCAGGGGATCG)、CTO189f C-GC(CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGAGGAAAGTAGGGGATCG)和CTO654r(CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC)[14-15]，40 μL的反应体系组成如下：20 μL BioLinker 2×Taq Mix，引物上游各1 μL，引物下游1 μL，模板1 μL 和适量的双蒸水补足40 μL。反应条件：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s； 56.4 ℃，30 s；72 ℃，30 s，30个循环，最后在72 ℃下延伸5 min。

1.4.3 变性梯度凝胶电泳 (1)将20 μL PCR产物加入到8%(w/v)的聚丙烯酞胺凝胶(37.5∶1)中，凝胶的变性范围为40%～60%[本研究中凝胶的100%变性为含有7 mol尿素和40%(v/v)的去离子甲酰胺(deionized Formamide)聚丙烯酰胺凝胶]；(2)将Bio-Rad制胶装置倾斜放置，通过Bio-Rad Model475 Gradient Delivery System灌胶系统以从顶部注入凝胶的填充方式进行梯度灌胶；下层胶凝固1～1.5 h后，灌上层0%胶；凝胶灌制完毕后，插入梳子；放置1～1.5 h，待胶凝固后，移除梳子，将凝胶装置放于Bio-Rad水浴系统中，使温度保持60 ℃；(3)电泳条件为：温度60 ℃，电压80 V，缓冲液l × TAE，电泳时间16.5 h，电泳完毕后，取出凝胶装置，置于磁钢容器中，加入400 mL Biolinker DNA Red染色液进行染色40 min；(4)置于Bio-Rad凝胶成像系统中观察拍照，进行凝胶影响分析。

1.4.4 样品指标的测定 水样中各形态氮浓度采用国标法《水和废水检测分析方法(第四版)》[16]测定；沉积物中TN过硫酸钾消解法测定；底泥的pH值通过质量与体积比1∶2.5的泥和水(0.01 mol/L KCl溶液)混合后测定浑浊液中的pH值[17]；底泥中有机质(OM)含量通过样品在550 ℃下煅烧4 h，样品质量差进行测定[18]；样品的金属氧化物成分通过X射线荧光分析仪来测定。

1.5 数据分析

1.5.1 底泥各形态氮释放通量 采用公式(1)和(2)进行计算[19]。

(1)

(2)

式中Mn——每次测定期内的释放量,mg；

V——泥样上覆水的体积,L；

Cn——第n次采样时水中营养盐浓度,mg/L；

C0——泥样上覆水的初始营养盐浓度,mg/L；

Vn——每次采集水样体积,L；

N——采样次数。

1.5.2 香农指数(Shannon) 用来估算样品中微生物的多样性指数之一，其公式为：

(3)

H为香农指数，S为DGGE胶中条带数量，Pi为第i条带灰度占该样品总灰度的比率。丰富度指数(S)即为某个样本中所有条带的总和。

1.5.3 均匀度指数(E) 用来描述群落中个体数量在物种中的分布均匀状况，亦是群落多样性指数之一，其公式为[20]：

E=H/Hmax=H/lnS

(4)

1.5.4 辛普森指数(D) 用来测定群落中物种多样性指数之一，其公式为[21]：

(5)

式中Ni为物种个体数，N为总个体数。

同时采用Quantiy one对微生物群落DGGE图谱进行分析、Canoco4.5用于主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)，Mothur等软件开展基于PCR-DGGE技术的氨氧化菌群落多样性研究。

2 结果与讨论

2.1 沉积物理化性质及各形态氮含量分析

4种沉积物的理化性质见表1。

表1 4种沉积物的理化特性(均值±标准误差)Table 1 Physicochemical properties(mean value± standard deviation) of four sediments

由表1可知，相比其他点位沉积物，#3沉积物中TN含量较高，其可能造成该点位较高的氮释放通量。有研究指出[22-24]，较高的有机质和金属氧化物含量有利于沉积物对各形态氮的吸附，因此会导致上覆水中氮含量的减小，其中#1沉积物含有较高的金属氧化物含量，该点位沉积物对上覆水中各形态氮有较强的吸附能力，可能会影响实验中沉积物氮的释放。沉积物中pH会影响AOB群落结构，AOB最适生长pH为7.5～8.0，因此，#2和#3沉积物中AOB群落多样性会相对较高。

2.2 沉积物氮释放通量

见图2(a)，NH4-N释放通量在实验第1 d达到最高值1.25 mg/(m2·d)，且#3的NH4-N释放通量远大于其他三个点位底泥的释放通量，这可能由于该点位沉积物TN含量最高所导致。此外，在第25 d，NH4-N的释放通量几乎接近0 mg/(m2·d)，这说明在25 d时，底泥已不再向上覆水释放NH4-N，且上覆水中NH4-N的浓度也较低；由图2(a)可知，在底泥NH4-N释放过程中，NH4-N的释放通量在0～7 d是快速减小阶段，在8～25 d内，其释放通量是缓慢减小阶段，直至趋于0；当释放通量接近于0时，这表明上覆水中的NH4-N浓度也处于一个相对低的状态，这可能是由于在整个模拟底泥释放的系统中，底泥表层的硝化菌，尤其是AOB在起作用。

由图2(b)可知，#2的NO2-N释放通量在第4 d达到了最高，0.03 mg/(m2d)，其他3个点位底泥均在第5 d时释放通量达到最高，依次为#3[0.09 mg/(m2d)]>#4[0.04 mg/(m2d)]>#1[0.035 mg/(m2d)]，其中#3沉积物NO2-N的释放通量最大，在第6～15 d内，NO2-N的释放通量又迅速下降，趋向平衡。NO2-N的释放通量呈现先增加后减小的趋势，这主要是由于实验开始阶段，沉积物向上覆水释放大量的NH4-N，经过一定时间，NH4-N被氧化成NO2-N，在反应器内，AOB是导致该现象的主要原因。

图2 NH4-N和NO2-N释放通量的变化曲线Fig.2 Changes of NH4-N and NO2-N fluxes

2.3 氮释放过程中AOB多样性指数变化

4个点位在不同时间点AOB群落结构的多样性指数见表2。

由表2可知，#1的Shannon Wiener指数呈现一个先增后减的趋势，在第13 d时达到2.434，说明#1的AOB数量和种类达到一定程度“饱和”后开始下降。#2的Shannon Wiener指数在第4 d时达到最大值2.280，这可能是因为#2的底泥性质导致AOB的繁殖速度较快所造成。#3的Shannon Wiener指数较小，在1.446～1.887之间，且前13 d内，指数大小变化不大(约为1.5)，在第21 d时，指数大小迅速增大，说明AOB群落的多样性上升。#4的Shannon Wiener指数所呈现的规律与#3相似，前13 d指数大小在2.005～2.170之间，变化不大，第21 d时指数大小增加至2.341，说明AOB群落的多样性上升。Simpson指数亦是反映群落多样性的一项指标，见表2，Simpson指数与Shannon Wiener指数的变化趋势基本一致。

表2 AOB多样性指数表Table 2 Diversity values of AOB

丰富度指数是指样品中所有条带数总和，由表2可知，第13 d时，#1的丰富度指数最大，即条带数最多，此时#1的样品中AOB物种数量最多，这也从侧面反映了#1在第13 d的AOB群落的多样性最高，和Shannon Wiener指数变化所呈现的趋势一样。#2的丰富度指数在16～18之间，变化不大，AOB物种数量变化较小。#3在前13 d内，各样品条带数相同，说明物种数量基本不变，在第21 d时，条带数量迅速上升，说明#3样品中AOB物种数量增加，群落多样性也随之发生变化。#4的丰富度指数则呈现一个上升的趋势，物种数量也稳步增加。

2.4 氮释放过程中AOB的DGGE图谱分析

氨氧化菌DGGE电泳图见图3(a)，从第1 d起，到第9 d，AOB条带总数、种类及灰度都发生了较大的变化，尤其是第9 d到第21 d过程中，条带数远大于前5个时期，说明在第21 d时，4个点位泥-水界面AOB的群落较为丰富，且结构发生了较大的变化。同时部分条带的灰度增大也说明了相关种群在泥-水界面占据了一定优势。在沉积物氮释放的前9 d，NH4-N的释放通量大幅度减小，除#3沉积物，其他3个点位沉积物NH4-N的释放通量在第9 d 时均趋向于0，沉积物-水界面AOB活跃，因此1～13 d的AOB条带总数变化较大。9～21 d期间，可能是由于硝化菌中的亚硝酸盐氧化菌的活跃导致条带数的增多。

见图3(b)，相较第21 d时AOB群落结构，#1、#2、 #3和#4均在第6 d时菌群结构变化最大，与第21 d 的相似度分别降至58.9%，76.9%，69.5%，57.6%；#1、#2、#3和#4底泥在第1，4，6，9 d菌群结构变化较为平缓，AOB种群结构无明显变化，在前9 d 的4个时间段与第21 d的相似度分别维持在58%～65%，76%～79%，69%～74%和57%～69%，这表明在9 d以内，不同种类的AOB在适应环境变化的此消彼长，9 d以后，AOB种群结构发生变化，这也是导致前9 d NH4-N的释放通量快速减小，NO2-N的释放通量先增加后减小，变化不稳定的主要原因之一；此外，#1和#4，在整个实验过程中，前9 d的AOB菌群结构与第21 d相比变化较大，主要是由于这两个点位沉积物pH值较低，迫使AOB群落不断适应环境而导致结构变化。

图3 氨氧化菌DGGE凝胶电泳图像(a)和经过Quantity One处理过后的电泳图(b)Fig.3 DGGE pattern of AOB(a) and DGGE pattern after the treatment by Quantity One(b)1～6样品分别表示第1，4，6，9，13，21 d样品

2.5 氮释放过程中AOB群落PCA和RDA分析

图4(a)为各点位AOB主成分分析，第一主成分可以解释总变量的57.2%，第二主成分可以解释总变量的20.4%，两个主成分共同解释随时间AOB群落变化的77.6%。4个点位的AOB群落结构在图上分别成簇出现，同一点位各时间段样品在主成分1和2上无明显差异，各点位之间在主成分1和2上表现差异明显。#3与其他3个点位在主成分1上有显著差异，说明#3沉积物-水界面AOB对主成分1代表的群落分布结构与其他3个点位不同。#2和#4沿PC2轴两端分布，#2和#4两个点位群落在主成分2上有显著差异，说明#2泥-水界面AOB对主成分2代表的群落分布结构与#4不同[25-26]。

将DGGE图谱数字化的4个点位各时间段AOB群落信息与实验系统中氨氮、亚硝氮、硝氮、pH和时间(Day)这5个外界环境因子进行冗余分析，考察不同点位不同时间段AOB和NOB与环境因子变量之间的关系。分析结果见图4(b)，用箭头表示各个环境因子，不同形状的图形表示不同点位样品的群落结构信息，箭头的长度表示AOB群落结构与该环境因子相关系数的大小，连线越长，相关性越高；箭头和排序轴所构成的夹角大小表示箭头代表的环境因子与排序轴相关性大小，夹角度数越小，相关性越高，箭头所处的象限表示该环境因子与排序轴相关系数的正负。

图4 4个点位沉积物实验期间AOB群落多样性PCA(a)和RDA(b)分析Fig.4 PCA(a) and RDA(b) of AOB community diversity for four sediments

由图4(b)可知，本研究中，RDA分析结果的双序图表明了各环境因子对各点位各时间段样品的影响：#4的大部分时间点样品(组Ⅰ)受到了NH4-N的显著影响，#2的4～21 d的时间点和#3的13～21 d 时间点样品(组Ⅱ)主要受到pH和NO3-N的影响，且受pH影响显著，#3的1～9 d和#1各样品(组Ⅲ)受到了NO2-N的影响，但影响不显著。

第一轴能解释AOB群落结构异变的28.4%，反映AOB群落结构和环境因子的相关系数为0.814；第二轴能解释AOB群落结构异变的9.3%，反映AOB群落结构和环境因子的相关系数为0.753，前两轴解释群落结构变化达到37.7%。#2和#4各时间段样品分别位于第一轴左右两端，说明#2和#4各时间点对环境适应的特点上相似；#1位于第二轴下端；#3则交替沿第二轴分布，说明#3各时间点样品适应环境的能力不同。NH4-N和pH与群落结构之间呈现了较好的相关性，数值分别为0.549 5和-0.472 1，通过Monte Carlo法检验后显示，p值分别为0.02和0.016，皆达到显著水平(p<0.05)。NO2-N、NO3-N和时间与AOB群落结构相关性较低，且没达到显著水平(p>0.05)。根据最大相关性得出结论，pH和NH4-N对AOB群落分布结构影响显著[27-28]。

3 结论

底泥表层AOB群落结构随着各形态氮释放通量变化而不断变化；PCR-DGGE技术分析发现，随着时间的变化，AOB群落在第9 d或13 d群落多样性最丰富，这也是实验模拟过程中，NH4-N释放通量在开始的前9 d迅速减小，NO2-N释放通量在13 d内浓度达到最高值的主要原因；4个点位的AOB群落结构在图上分别成簇出现，同一点位各时间段在主成分上无明显差异；pH和NH4-N对AOB和NOB群落分布结构影响显著。