新疆部分地区牛环形泰勒虫优势种媒介蜱的分子生物学鉴定及种群结构分析

2021-11-13谢小婉朱马别克胡斯曼加那尔努和买提木哈里吾汗王志斌

现代畜牧兽医 2021年10期

谢小婉，朱马别克·胡斯曼，加那尔·努和买提，木哈里·吾汗，王志斌

（达坂城区柴窝堡片区管理委员会兽医站，新疆乌鲁木齐 830052）

牛环形泰勒虫病是环形泰勒虫引起的一种蜱传血液原虫病。该病在南欧、中亚和中东等地区均有不同程度的流行。我国在西北、东北、华北地区均对该病的流行情况进行过调查[1-2]，结果显示，吐鲁番为该病最为严重的疫区之一。虽然每年都会定期针对该病进行疫苗接种，但该病的感染率和发病率仍呈上升趋势，其中吐鲁番市发病率高达40%[3]，严重阻碍养牛业的发展。该病的主要传播媒介是璃眼蜱属的璃眼蜱[4]。调查显示，媒介蜱的区系分布、病原携带率和遗传多样性是蜱传疾病的主要影响因素。因此，掌握璃眼蜱的区系分布、群落结构和物种组成，对媒介蜱的防控以及蜱传疾病的防控具有参考意义。本试验通过体视显微镜对8个试验点所采集的璃眼蜱（N=9 141）进行分子生物学鉴定，分析区系分布特点、种类组成及相对优势度，明确璃眼蜱种群分布和活动范围的变化，对该地区媒介璃眼蜱及蜱传牛环形泰勒虫病的流行和流行区的变化提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2016～2017年是蜱类活动的高峰期。在吐鲁番和阿勒泰地区的8 个试验点，随机抽取56 头牛以及璃眼蜱9 141 枚。按照文献记载采集牛体表的全部硬蜱[5-6]，记录采集时间、地点等[7]。

1.2 试剂与仪器

ITS2璃眼蜱引物（由上海生工生物工程有限公司合成）；树脂型TM基因组DNA提取试剂盒和快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司；高纯度质粒小提取试剂盒分别购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA的提取

璃眼蜱属特异性引物[8]序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

50 μL 反应体系：2×EcoTaq PCR SuperMix25 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各1 μL，璃眼蜱DNA 3 μL，双蒸水加至50 μL。

PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃再延伸10 min。

经1.0%琼脂糖凝胶电泳检查、PCR扩增得到结果。目的片段纯化、克隆，对所获得的菌液进行PCR验证，将菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行同源性分析。

1.3.2 璃眼蜱群落组成参数的计算[9-16]

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

2.1.1 媒介蜱分子生物学鉴定结果（见图1）

图1 璃眼蜱ITS2基因序列PCR扩增结果Fig.1 PCR product of Hyalomma ITS2 gene

由图1 可知，以璃眼蜱属ITS2基因序列，采用PCR 的方法扩增璃眼蜱DNA，于490 bp扩增出目的条带。

2.1.2 重组质粒Peasy-T1-ITS-2的序列对比结果

测序结果经BLAST 检索，显示本次实验室获得目的片区与GenBank 中小亚璃眼蜱、残缘璃眼蜱、嗜驼璃眼蜱和亚洲璃眼蜱核苷酸相似性在99%～100%之间，为本研究的目的片段。经PCR鉴定：小亚璃眼蜱3 750枚，残缘璃眼蜱2 468枚，亚洲璃眼蜱914枚，嗜驼璃眼蜱2 009枚。

2.2 新疆部分地区璃眼蜱的群落结构分析

2.2.1 新疆部分地区璃眼蜱相对优势度、染蜱率和蜱指数（见表2）

表2 采集璃眼蜱相对优势度、蜱指数和染蜱率Tab.2 Relative dominance,infested indexes and infested ratesof Hyalomma

由表2可知，试验所抽检的8个试验点中的56头牛，共计采集媒介璃眼蜱9 141 枚。其中，小亚璃眼蜱相对优势度、染蜱率及蜱指数均为最高分别为41.02%、100%、66.96；亚洲璃眼蜱的相对优势度最低为10.00%；染蜱率最低的是嗜驼璃眼蜱，为30.00%；亚洲璃眼蜱蜱指数最低，为16.32。

2.2.2 新疆部分地区牛体表寄生璃眼蜱群落结构参数（见表3）

由表3 可知，采集到牛体表的璃眼蜱的物种丰富度为4，多样性指数为1.282 3，物种均匀度指数为0.925 0，优势度指数为0.299 4。

表3 寄生璃眼蜱种群、群落组成参数Tab.3 Community structure parameters of parasitic Hyalomma

2.2.3 新疆部分地区璃眼蜱的区系分布（见表4）

由表4 可知，4 种璃眼蜱中，小亚璃眼蜱蜱指数最高，为625.00，占总体的41.02%（625.00/1 523.51），亚洲璃眼蜱蜱指数最小为10.00%（152.34/1 523.51）。由采集地点来看，吐鲁番市（包括夏乡、吐鲁番市、伊拉湖乡、博斯坦乡4 个地区）蜱总指数为937.67，占蜱总数指数的61.55%（937.67/1 523.51），其中夏乡的蜱总指数最高，为19.84（302.34/1 523.51）；阿勒泰地区（包括富蕴县、清河县、哈巴河县和福海县四个地区）蜱总指数为502，占总数的32.95%（502.00/1 523.51），其中青河县的蜱指数较低，占蜱总指数的 6.12%（93.17/1 523.51）。

表4 不同生境寄生媒介璃眼蜱的蜱指数Tab.4 Infested indexes of parasitic Hyalomma in different regions

2.2.4 新疆部分地区牛体表寄生璃眼蜱群落结构参数（见表5）

由表5可知，伊拉湖乡种类丰富度为2，较其他7个试验点低；富蕴县多样性指数最高，为1.171 0；伊拉湖乡物种均匀度指数最高，为0.966 4。清河县多样性指数、均匀度指数均最低，分别为0.5649、0.4075；但优势度指数最高，为0.7089。

表5 不同生境璃眼蜱的群落结构参数数据Tab.5 Community structure parameters of parasitic Hyalomma in different regions,Xinjiang

3 讨论

璃眼蜱的鉴定主要依据形态学[17-18]。分子生物学具有操作简单、准确率高、适用范围广等优势，不仅能鉴定形态较为完整的媒介蜱外，还可以精确鉴定残缺、饱血和不成熟的媒介蜱[18]，被广泛运用于媒介蜱的鉴定。ITS2基因因进化速率快且GenBank 数据量丰富，被用于媒介蜱属内、种间或种内的系统进化关系研究[6,19]。文章通过ITS2基因检测采集的9 141璃眼蜱，共鉴定出4种璃眼蜱：小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱和嗜驼璃眼蜱，分别为3 750、914、2 468、2 009枚。1959年，肖成恩[20]首次报道新疆地区媒介硬蜱分类情况。1963年和1977年，于心等[5，21]详细地记载了新疆媒介蜱的种类、形态特征、生物学特性、地理分布、携带病原情况以及媒介蜱的防治，均为媒介蜱及蜱传疫病提供详细的参考资料。但随着全球气候变暖，璃眼蜱的种群分布有所变化[22]。王冰洁[23]从绵羊和山羊体表获得了寄生于牛、马、骆驼的残缘璃眼蜱，在马体表采集到了仅寄生于骆驼的嗜驼璃眼蜱。朱玉涛[24]在布尔津县、福海县首次采集到刻点血蜱和图兰扇头蜱，在富蕴县首次采集到银盾革蜱和森林革蜱，在硕县首次采集到银盾革蜱和草原革蜱。因此，研究不同生境、不同宿主体表寄生媒介蜱的种群结构、区系分布十分必要。通过分子生物学结合统计学对吐鲁番和阿勒泰地区牛体表媒介蜱进行鉴定，并进行群落结构分析。结果显示，小亚璃眼蜱蜱指数、染蜱率、相对优势度均最高，其相对优势度高达41.02%，多样性指数为1.282 3，物种均匀度指数为0.925 0，优势度指数为0.299 4。吐鲁番市多样性指数和物种均匀度指数均较高，但是优势度指数较低，优势度指数和多样性指数呈反比的关系。调查发现，吐鲁番和阿勒泰地区寄生媒介璃眼蜱无差异，丰富度均为4，分析与牛的调出、调入有直接关系，要做好调出、调入牛检疫工作，检测牲畜时也要做好媒介蜱检测。此外，吐鲁番市气候类型属于大陆性暖温带荒漠气候，阿勒泰地区属于的温带大陆性寒冷气候表现均为降水量少，蒸发量大；吐鲁番坎儿井及大范围种植葡萄树，而阿勒泰拥有辽阔的草原；独特的气候条件和复杂的地貌环境和土壤结构，为媒介璃眼蜱的滋生提供可行、适宜的生存条件。