固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定兽药制剂中非法添加8 种硝基咪唑类药物

张海超，贾海涛，张婧雯，王 敬，艾连峰*，霍惠玲，李研东

（1.石家庄海关技术中心，河北 石家庄 050011；2.河北省兽药监察所，河北 石家庄 050050）

硝基咪唑类药物是一类广泛应用的人工合成药物，具有5-硝基咪唑基本结构，对原虫以及各种厌氧细菌具有显著的抑制作用，能促进牛、猪、禽的生长及改善饲料转化率。用于兽药的硝基咪唑类药物主要包括地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑和替硝唑等[1]。但是，由于硝基咪唑类药物具有细胞诱变性，有潜在的动物致畸、致癌性和致突变作用，其残留对动物源性食品安全构成直接威胁。因此，我国农业农村部公告第250号中将罗硝唑和替硝唑列为食品动物禁止使用的药品[2]。目前，关于兽药中非法添加硝基咪唑类药物的标准有《农业农村部公告第289号兽药中非法添加硝基咪唑类药物检查方法》，采用液相色谱法测定罗硝唑、甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、奥硝唑和异丙硝唑含量，检测限为1 mg/g[3]，但此方法存在灵敏度低、抗干扰能力差等缺点。马东杰等[4]采用液相色谱串联质谱法测定中兽药制剂中甲硝唑、地美硝唑、异丙硝唑和罗硝唑的含量，检出限为10 μg/kg，虽然灵敏度高，但测定化合物数量有限，故该方法仍存在一定局限性。其他关于硝基咪唑药物检测文献中的测定方法多为饲料[5-7]和动物源性食品[8-10]基质，关于适用兽药制剂基质的测定方法较少。因此，建立一种可靠的测定兽药制剂中非法添加硝基咪唑类药物方法对兽药行业发展具有重要意义。文章选取4种兽药制剂为代表性基质样品，对提取溶剂、净化方式及色谱条件进行研究，采用SCX柱净化，建立兽药制剂中硝基咪唑类药物的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法。该方法操作简单、净化效果好，可为测定兽药制剂中非法添加硝基咪唑类药物提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

8050 液相色谱-串联质谱仪（SHIMADZU 公司）、KQ-500E 超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）、Sigma 3K-15 型离心机（Sigma 公司）、PT2100 型均质器（KINEMATICA 公司）、涡旋混合器（Scientific Industries）、Milli-Q纯水系统（Millipore公司）。

色谱纯乙腈、甲醇、丙酮、氨水，购自飞世尔试剂公司；分析纯氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司；试验所用纯水均由美国Milli-Q纯水系统制得。

标准品：地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、替硝唑，纯度大于97%。混合型阳离子（SCX）固相萃取柱（150 mg/6 mL，Agela公司）。

1.2 混合标准溶液的配制

分别称取8种硝基咪唑类药物标准品10.0 mg（折合纯度后）于10 mL 棕色容量瓶中，使用甲醇溶解，定容，得到浓度为1 g/L的单标储备液，于4 ℃下避光保存。准确移取适量硝基咪唑标准储备液，使用甲醇稀释成混合标准工作液，待用。

1.3 样品前处理

固体样品：称取2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈溶液，混匀，均质器10 000 r/min均质1 min。

液体样品：称取2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 乙腈溶液和4 g 氯化钠，混匀，均质器10 000 r/min均质1 min。将各样品提取液以4 000 r/min离心5 min，取上清液待净化。

SCX固相萃取柱依次用甲醇、乙腈各取5 mL活化，将5 mL 上清液过柱，依次用5 mL 丙酮、5 mL 甲醇淋洗，压干。使用6 mL 5%氨水甲醇洗脱，40 ℃下氮气吹干，准确加入50%甲醇溶液溶解残渣混合均匀，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱进行测定。

1.4 分析条件

色谱柱为Waters BEH C18柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；柱温为35 ℃，进样量1 μL；流动相：A 为0.1%甲酸水，B 为乙腈；流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.5 min，5% B；0.5～4.0 min，5%～90% B；4.0～6.0 min，90%B；6.0～6.1 min，90%～5%B；6.1～8.0 min，5%B。

质谱条件：电喷雾电离源ESI，采用多反应监测（MRM）正离子扫描模式。离子源温度为300 ℃，毛细管温度为250 ℃，加热模块温度为400 ℃，氮气流速3.0 L/min，干燥气流速10.0 L/min，加热气流速10.0 L/min，其他参数见表1。

表1 8种硝基咪唑类药物的质谱参数Tab.1 MS parameters of eight nitroimidazole

2 结果与分析

2.1 兽药制剂种类的选择

鱼腥草注射液主要成分为鱼腥草，主要作用为清热解毒、消肿排脓、利尿通淋。硫酸新霉素可溶性粉主要用于治疗禽敏感革兰氏阴性菌所致的胃肠道感染。荆防解毒散主要成分为荆芥、防风、羌活、独活、柴胡等，主要功能是辛温解表，疏风祛湿。白头翁口服液主要成分是白头翁、黄连、秦皮、黄檗，主要功能是清热解毒、凉血止痢。硝基咪唑类药物因其类似功能极有可能加入上述兽药中。因此，本试验选用上述4种兽药分别作为针剂、粉剂和酊剂的代表性样品。

2.2 提取条件的选择

常用于硝基咪唑类药物分析的提取溶剂主要有乙酸乙酯、乙腈、甲醇等。本研究先后试验了乙腈、乙酸乙酯、甲醇和二氯甲烷，结果表明，4种提取剂对硝基咪唑类药物均有很好的提取效率。但考虑到二氯甲烷比重大，提取离心后上清液中仍会有样品残渣悬浮，转移较为费力且毒性较大；甲醇沉淀蛋白不完全离心静置后仍有白色絮状物产生，不利于之后的净化环节；乙酸乙酯脂溶性较强，提取脂溶性杂质较多，不利于浓缩。结合试验操作简便性与样品基质类型，最终选择乙腈作为提取剂。

本试验通过对阴性样品添加分析物，比较了一次性加入20 mL 乙腈均质提取与分两次每次各10 mL 加入乙腈均质提取之间的提取效率差异，结果表明，两种方式的回收率基本持平。样品再次加入20 mL 乙腈，回收率不变。因此，在保证结果准确的前提下，为提高检测效率，标准选择一次性加入20 mL 乙腈即可提取完全。考虑到水和提取溶剂间极性的差异，粉剂样品中含水量的不同很可能影响硝基咪唑类药物的提取效率。以荆防解毒散样品为例，向样品中加适量蒸馏水浸泡，采用20 mL 乙腈进行提取。结果表明，样品中含水量上升会导致杂质提取较多，引起硝基咪唑类药物提取效果的降低。因此，试验对于粉剂样品采用乙腈直接提取，针剂和酊剂样品含有一定水分，采用均质提取前需要加入5 g 氯化钠和乙腈进行盐析提取。

2.3 净化方式的选择（见图1、图2）

由于很多兽药中含有中药成分，在生产过程中需经过煎煮、蒸馏、添加辅料等制作工艺，基质较为复杂，所以选择固相萃取柱进行净化。在500 μg/kg 添加水平时，采用不同类型的固相萃取柱，包括C18柱（反相萃取柱）、氧化铝柱（正相萃取柱）和SCX 柱（硅胶基质强阳离子交换柱）。以荆防解毒散为例，各化合物的净化效果见图1。

由图1 可知，用C18柱净化效果较差，基质影响比较严重；用硅胶柱和氧化铝柱处理，8种药物的绝对回收率均小于60%；用SCX 柱不仅可以消除干扰，同时8 种硝基咪唑类药物回收率均在70%～90%以上。强阳离子交换柱上的磺酸基能有效地吸附质子化的硝基咪唑类药物，即使是极性强的有机溶剂亦不能洗脱。用丙酮、甲醇可以淋洗掉大部分干扰成分，然后用5%氨水-甲醇置换洗脱目标分析物。本试验选用6 mL 500 mg 的SCX 强阳离子交换柱，5 mL丙酮和5 mL甲醇淋洗杂质，最后用氨水-甲醇（5+95）洗脱并收集。

图1 8种硝基咪唑类药物净化效果比较Fig.1 Comparison of purification effects of eight nitroimidazoles

由图2 可知，为达到更好的净化效果和更高的洗脱比例，试验对洗脱体积采用分段收集的方式进行考察，当洗脱体积为5 mL时净化柱的洗脱比例均小于5%，第6 mL时已无任何目标物流出。同时，硝基咪唑类药物热稳定性差，氮吹步骤应注意不能将其完全吹干，若完全吹干就会降低方法的回收率，尤其是卡硝唑吹干后会损失80%。

图2 8种硝基咪唑类药物的梯度洗脱曲线（n=3）Fig.2 Gradient elution curves of eight nitroimidazoles(n=3)

2.4 仪器条件的优化（见图3）

采用不接分析柱的方式向质谱系统注入1 mg/L 的标准溶液，进样量为1 μL。确定各化合物的最佳质谱分析条件，包括离子源温度、毛细管温度、加热模块温度、加热气流速、干燥气流速、氮气流速、选择特征离子对、Q1 和Q3电压、碰撞能量等。各化合物的标准溶液和HPLC的流动相溶液混合进入ESI 电离源，在正负离子同时扫描方式下进行一级全扫描质谱分析，其分子离子峰[M+H]+峰响应值最高。在正离子模式下对[M+H]+峰进行子离子扫描得到主要的子离子，并选择响应值高的子离子进行碰撞能量的优化，最终确定多反应监测的离子对及碰撞能量，8种硝基咪唑混合标准溶液的MRM色谱图见图3。

图3 8种硝基咪唑混合标准溶液的MRM色谱图Fig.3 Quantiativeion chromatogramsof eightmixedstandardsolution of nitroimidazole

2.5 基质效应（见图4）

图4 8种硝基咪唑基质效应Fig.4 Matrix effects of eight nitroimidazoles

基质效应（ME）是指色谱分离时共洗脱的物质无法更改待测成分的离子化效应，所引起的信号的抑制或提高。基质效应影响大时会降低方法的灵敏度，影响方法的准确性，给测定带来误差。因此，液相色谱-串联质谱方法开发和确证过程中需要对ME（ME=（基质匹配标准曲线的斜率/纯溶剂标准曲线的斜率）×100%）做出评价。一般认为，基质效应在85%～115%之间不明显。考虑到兽药基质复杂，容易对目标物产生干扰，文章通过配制标准工作曲线和基质匹配校正曲线，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标作图，以基质匹配校正曲线和标准曲线斜率的比值来考察化合物的基质效应。由图4可知，经此方法净化所得的样液不存在明显的基质效应。因此，本方法可采用溶剂标准溶液进行准确定量。

2.6 方法学评价

2.6.1 线性关系、检出限和定量限（见表2）。

表2 8种硝基咪唑类药物的线性范围、线性方程和相关系数Tab.2 Linear equations,correlation coefficients of eight nitroimidazole

上述方法所确定的试验条件下，分别配制浓度为10、20、50、100、200、500 μg/L 6 个标准系列进行测定，以定量离子的响应峰面积（y轴）对相应的质量浓度（x轴，μg/L）作图。由表2 可知，8 种硝基咪唑在10～500 μg/L 范围内时，定量离子的响应峰面积和样品浓度之间有良好的线性关系，其相关系数均大于0.999。参考GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中目视评价法评估LOD，从可信性考虑确定LOQ的方法，试验以空白添加法，并根据前处理过程提取净化的稀释倍数以及进行测定时所受的干扰情况，确定方法的检出限为0.02 mg/kg，定量限为0.05 mg/kg。

2.6.2 回收率和精密度（见表3）

表3 8种硝基咪唑类药物的平均加标回收率和相对标准偏差（n=6）Tab.3 Average spiked recoveries(A.R.)and relative standard deviations(RSDs)of eight nitroimidazole(n=6)

选取不含8 种硝基咪唑的4 种代表性基质样品，即鱼腥草注射液、硫酸新霉素可溶性粉、荆防解毒散和白头翁口服液为空白样品基质，在1、2、10倍定量限的添加水平上进行添加回收率试验，每个水平重复做6次，测得本试验方法的回收率范围为84.1%～101.6%，精密度范围为2.74%～11.60%。

2.7 实际样品的测定

为评价该方法的有效性，随机对送检的止疟散、清瘟败毒散等20份兽药制剂样品进行检测，结果有1份样品清瘟败毒散检出甲硝唑，样液经稀释进样，含量最终确定为220 mg/kg。

3 结论

试验应用SCX 固相萃取净化技术，以高效液相色谱-串联质谱法建立了兽药制剂中8种硝基咪唑类药物的检测方法，操作简便、快速、灵敏度高，可为打击兽药制剂中非法添加硝基咪唑类药物的制假行为提供有力的技术支持。