芽孢杆菌不同菌种抑菌性强度试验比较分析

周淑贞，辜质纯，李成应，张瑞雪，张 悻，顾万军，黄良宗*

（1.佛山市南海东方澳龙制药有限公司，广东 佛山 528234；2.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528231）

芽孢杆菌（Bacillus）是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色阳性、产芽孢的杆状细菌。芽孢杆菌种类繁多、数量庞大，是自然界中广泛存在的非致病性细菌[1-2]。芽孢杆菌作为饲料添加剂可提高饲料利用率，降低饲养成本，预防和减少疾病的发生。某些天然活性物质，如抗菌肽，具有潜在的可能性，特别是来源于芽孢杆菌的抗菌肽，因其广谱抗菌能力以及较为高效的活性而备受关注[3]。芽孢杆菌海陆共栖，是一类公认的抗菌肽或细菌素产生菌[4-6]。抗菌肽的肽链结构通过与酰基连接的脂肪酸形成脂肽，由环形肽和脂肪酸组成的脂肽，具有抗菌谱广、作用迅速强大、不易产生耐药性等优点[7]。细菌素是由细菌核糖体合成的抗菌肽，一般作用于目标菌株细胞膜，通过破坏膜结构完整性、造成细胞内容物渗漏进而导致细菌死亡。这种不同于抗生素的作用机制使细菌素成为新型抗菌活性物质的研究热点[4]。

本文从不同环境和益生素产品中分离鉴定12 种共21 株芽孢杆菌。应用滤纸片方法进行芽孢杆菌抑菌性的比较试验，筛选抑菌性较强的菌株，为益生素的应用研究和芽孢杆菌抗菌肽研发的候选菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 培养基

LB培养基琼脂：葡萄糖10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蛋白胨10 g、琼脂17 g（固体培养基添加），调节pH 值7.0，121 ℃，20 min灭菌，备用。

1.2 指示菌

大肠杆菌（K12D31）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

1.3 试验菌株及来源

试验分离芽孢杆菌菌种（株）均分离自自然环境和益生菌产品，见表1。

表1 试验分离鉴定菌种（株）来源Tab.1 Isolate and identify the source of strain

1.4 细菌培养

1.4.1 指示菌培养

将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种于LB 培养基，37 ℃，120 r/min 培养16～24 h，细菌浓度约为OD600nm=1.0，取出，4 ℃保存，备用。

1.4.2 枯草芽孢杆菌培养

将枯草芽孢杆菌应用普通琼脂平板分离培养，挑取典型菌落，接种于LB培养基，37 ℃，120 r/min培养24 h，取出菌液，置4 ℃，备用。

1.5 抑菌试验

1.5.1 指示菌抑菌平板制备

取熔化后冷却至50～56 ℃LB琼脂，取指示菌液，加每平皿约20 μL，浇注平板，风干表面凝集水，备用。

1.5.2 纸片抑菌法

取出待测枯草芽孢杆菌菌液，使用滤纸片（直径6 mm，121 ℃、20 min 干燥，备用）蘸取被测菌液（约15～20 μL），贴附指示菌平皿表面，以培养基做对照，每株菌做3 皿次重复，置37 ℃，18～24 h 取出，使用游标卡尺计量抑菌圈直径（mm），记录结果。

1.5.3 结果判定

参照药物敏感性判定标准，判定抑菌强度。抑菌圈直径0 mm判定为“-”；10 mm以下为“+”；10～14 mm为“++”；15～20 mm为“+++”；20 mm以上为“++++”。

2 结果与分析

2.1 试验分离菌种鉴定（见图1、图2）

图1 12种21株芽孢杆菌16S rDNA序列同源性比较Fig.1 Comparison of 16S rDNA sequence homology of 21 Bacillus strains from 12 species

试验分离的芽孢杆菌菌种通过分离纯化，对16S rDNA 基因片段测序，并与基因BANK 数据库进行序列同源性比较，并建立试验菌种（株）系统发育树。由图1、图2可知，分离用于试验的菌株均为芽孢杆菌。

图2 12种21株芽孢杆菌16S rDNA序列系统发育树Fig.2 16S rDNA sequence phylogenetic tree of 21 Bacillus strains from 12 species

2.2 试验分离鉴定芽孢杆菌种抑菌性比较（见表2、图3～图5）

表2 不同来源12种芽孢杆菌抑菌性筛选比较结果Tab.2 Bacteriostatic screening and comparison of 12 Bacillus isolates from different sources

图3 芽孢杆菌抑菌试验（1）Fig.3 Bacteriostatic test of Bacillus(1)

图4 芽孢杆菌抑菌试验（2）Fig.4 Bacteriostatic test of Bacillus(2)

图5 芽孢杆菌抑菌试验（3）Fig.5 Bacteriostatic test of Bacillus(3)

由表2、图3～图5可知，同一菌种，如4株枯草芽孢杆菌之间抑菌强度不同，枯草芽孢杆菌07 和16 对金黄色葡萄球菌的抑菌强度达到“++++”，但对大肠杆菌的抑菌强度较弱仅达到“++”；其他菌种，如海氏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的2株菌的抑菌强度也有差异。不同菌种之间抑菌强度差异明显，尤其是对大肠杆菌的抑菌强度更为突出。枯草芽孢杆菌07 菌株、枯草芽孢杆菌16 菌株、贝莱斯芽孢杆菌02 菌株和韦氏芽孢杆菌A菌株对金黄色葡萄球菌抑菌强度达到“++++”，对大肠杆菌的抑菌强度达到“++”以上。芽孢杆菌sp.菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌强度达到“+++”。

3 讨论

枯草芽孢杆菌作为益生菌饲料添加剂已纳入农业农村部饲用益生菌名录，并得到广泛应用[8]。根据益生菌饲料添加剂研发、生产和应用的实践认为，芽孢杆菌的不同菌种抑菌强度也不同。本试验对不同来源的芽孢杆菌种的抑菌试验比较也证明了上述观点。周映华等[9]对3株芽孢杆菌进行生理功能分析，结果表明，试验用3种芽孢杆菌对病原菌的抑制效果无显著差异，因此进一步猜测原因可能是指示菌种类有限，不能清晰反映芽孢杆菌的作用特点，也可能是芽孢杆菌不同菌株的抑菌作用本身就是多方式的。芽孢杆菌多种多样，其代谢产物也不尽相同，细菌素是许多细菌的核糖体合成肽，可用于对抗致病菌和抗生素耐药菌[10]，而且细菌素的抗菌机制通常针对与生产者相同或密切相关的物种，作用范围比较狭窄。然而，芽孢杆菌属除了核糖体产生细菌素之外，还能产生非核糖体合成的脂肽，因而表现出广谱的抗菌活性[11-12]。因此，上述不同结果可能是由芽孢杆菌代谢产物不同、抑菌作用方式多样化造成的。

芽孢杆菌是一类公认的抗菌肽产生菌。抗菌肽通过干扰细胞壁的合成或通过在细胞膜上形成孔来对抗靶细胞[13]。芽孢杆菌的抑菌作用强度主要取决于产生抗菌肽的性质和产生量[14-16]。源自芽孢杆菌的抗菌肽，因其广谱抗菌能力以及较为高效的活性而备受关注。本试验通过培养条件、培养基筛选或单菌多次级代谢策略比较筛选出4种（5株）芽孢杆菌所产生的抗菌肽具有抑菌性，但是抗菌肽产生量的提高有待于进一步研究。

通过抑菌强度比较的4 种（5 株）芽孢杆菌，其中贝莱斯芽孢杆菌02菌株、韦氏芽孢杆菌A菌株对金黄色葡萄球菌抑菌强度达到“++++”，对大肠杆菌的抑菌强度达到“++”以上。芽孢杆菌sp.菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌强度达到“+++”，使得芽孢杆菌抗菌肽的研究更具重要价值。目前，有报道称韦氏芽孢杆菌可产生能杀死线虫的挥发性物质[17]，关于抑菌性的报道较少。有学者研究贝莱斯芽孢杆菌粗提物对于食源性金黄色葡萄球菌的作用，结果表明，贝莱斯芽孢杆菌对于食源性金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用[18]。此外，从青海藏羊瘤胃中分离筛选出的贝莱斯芽孢杆菌对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜梭菌有较强的抑菌能力，且抗逆性强、生长速度快[19]。有研究者从虾肠道分离出一些芽孢杆菌菌株，发现芽孢杆菌sp.T-J-1 可有效抑制拟态弧菌Vibrio mimicus、温和气单胞菌Aeromonas sobria、副溶血性弧菌V.parahaemolyticusATCC17802、大肠埃希菌Escherichia coli的生长，并认为BacillusspT-J-1在水产养殖中（尤其是虾的养殖）具备开发利用的价值[20]。综上所述，本研究与他人的研究结果基本一致。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别为革兰氏阳性和阴性细菌。相比革兰氏阳性细菌（G+细菌），能有效拮抗革兰氏阴性细菌（G-细菌）的细菌素更为稀缺。早在2009年，有学者研究发现，枯草芽孢杆菌大肠杆菌拮抗作用较为明显[21]，本研究也证明这一观点。多黏菌素是目前针对G-细菌感染的最后一道防线。对多黏菌素不敏感的超级细菌在世界范围内多有报道，能抑制G-细菌的海洋细菌素有可能成为多黏菌素的替代方案[22]。本研究为益生素菌株应用和芽孢杆菌抗菌肽研发的候选菌株选择奠定基础。

4 结论

枯草芽孢杆菌07菌株、枯草芽孢杆菌16菌株、贝莱斯芽孢杆菌02 菌株和韦氏芽孢杆菌A 菌株对金黄色葡萄球菌抑菌强度达到“++++”，对大肠杆菌的抑菌强度达到“++”以上。芽孢杆菌sp.菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌强度达到“+++”，对大肠杆菌的抑菌强度也达到“+++”。对于芽孢杆菌，同一菌种的不同菌株抑菌强度不同；不同菌种之间，抑菌强度差别明显，并且不同菌种对大肠杆菌的抑菌强度尤为突出。