miR-29及靶基因IFN-γ对痰菌阴性肺结核的诊断价值分析

李阳 芦迪

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的，是主要通过呼吸道传播的慢性传染性疾病，已受到全球各国的关注，也是我国重点控制的疾病之一[1]。在全球30 个结核病高负担国家中，我国排名第二，如何进一步提高结核病的诊治水平已成为临床医生重点关注的问题之一[2]。结核病防治的原则为早发现、早治疗，但不少肺结核患者因排菌少，导致痰检阴性，影响临床诊断[3]。报道指出，miR-29 可调节T 细胞分化，在病原体感染和机体抗感染免疫反应中发挥了重要作用[4]。而miR-29 与结核病的发病及病情进展密切相关，IFN-γ 是其靶基因[5]。因此，本研究通过探讨miR-29 及靶基因IFN-γ 在痰菌阴性肺结核的表达水平，分析其对痰菌阴性肺结核的诊断价值，为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2018年3月～2019年3月我院收治的痰菌阴性肺结核患者200 例（痰菌阴性组），痰菌阳性肺结核患者200 例（痰菌阳性组），另选取健康体检人员200 例作为对照组。痰菌阴性肺结核患者纳入标准：①均按结核分枝杆菌痰涂片阳性或培养阳性确诊；②符合菌阴活动性肺结核诊断标准[6]；③患者病情稳定；④无意识障碍。痰菌阳性肺结核患者纳入标准：痰标本涂片镜检结果均显示抗酸杆菌阳性，其余与痰菌阴性肺结核诊断标准相同。排除标准：既往结核病患者；精神疾病患者；研究中途退出者；妊娠期女性。痰菌阴性组，男124例，女76 例，年龄18～69 岁，平均（42.63±7.57）岁；痰菌阳性组，男119 例，女81 例，年龄20～70 岁，平均（41.98±7.86）岁；对照组，男131 例，女69 例，年龄19～71 岁，平均（43.63±8.12）岁。三组一般资料对比，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 研究方法取患者早晨空腹静脉血10ml，进行EDTA 抗凝，并加入淋巴细胞分离液5ml，400g 离心30min，然后吸取中层单核细胞，以磷酸盐缓冲溶液重悬。以磁性活化细胞分选法对CD4+细胞进行筛选，TRIzol 裂解细胞。以酚氯仿对总RNA进行抽提，然后以分光光度计对其RNA 质量进行测定，并以琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。反转录为cDNA。miR-29:①逆转录反应，16℃ 30min，42℃40min，85℃ 5min；②荧光定量PCR，95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火60s，40 个循环。靶基因IFN-γ：①逆转录反应，30℃ 10min，42℃30min；②荧光定量PCR，90℃预变性1min，55℃变性1min，72℃退火1min，30 个循环，然后72℃延伸10min。最后以U6RNA 作为内参基因，利用2-ΔΔCt法计算各样本中miR-29a、miR-29b、miR-29c、靶基因IFN-γ mRNA 的表达量。引物序列见表1。

表1 miR-29a、miR-29b 、miR-29c 及靶基因IFN-γ的引物序列

1.3 统计学分析使用SPSS 24.0 对本研究中的数据进行处理，计量资料用±s表示，采用t检验或方差分析，P<0.05 时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA水平比较痰菌阳性组和痰菌阴性组的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。痰菌阴性组和痰菌阳性组的miR-29a、IFN-γmRNA 水平均较对照组低，miR-29b、miR-29c 水平均较对照组高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 三组miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA 的水平比较（±s）

表2 三组miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA 的水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05

组别 miR-29a miR-29b miR-29c IFN-γmRNA对照组（n=200） 0.86±0.23 0.93±0.25 0.83±0.21 1.00±0.02痰菌阳性组（n=200） 0.51±0.12* 2.61±0.87* 2.68±0.92* 0.16±0.07*痰菌阴性组（n=200） 0.49±0.10* 2.52±0.81* 2.59±0.88* 0.16±0.05*

2.2 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA对痰菌阴性肺结核诊断价值的比较ROC 曲线分析结果显示，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 诊断痰菌阴性肺结核的AUC 分别为0.872、0.859、0.864、0.896，灵敏度分别为84.0%、81.5%、83.0%、89.5%，特异度分别为93.0%、90.5%、92.0%、91.5%。见表3和图1。

表3 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 对痰菌阴性肺结核诊断价值的比较

图1 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 对痰菌阴性肺结核诊断价值的ROC 曲线

3 讨论

近年来的流行病学研究结果显示，我国结核病发病率总体呈逐年下降趋势,但下降趋势缓慢[7，8]。而大多数结核潜伏感染人群早期并无活动性结核的明显临床症状，存在进展为活动性结核的可能[9]。目前，结核病的常用诊断手段为影像学检查及病原学检查，但均存在一定的假阴性结果，这不利于结核病的防治[10，11]。因此，探讨新的诊断方法对提高结核病的诊断水平具有重要意义。因此，本研究通过探讨miR-29 及靶基因IFN-γ 在痰菌阴性肺结核的表达水平，为痰菌阴性肺结核的诊断提供参考依据。

miRNA 是一种单链小分子RNA，miR-29a、miR-29b 和miR-29c 均是其家族成员[12]。报道显示miR-29 家族在机体免疫应答中发挥重要的作用，其靶基因相关蛋白通过抑制多个信号通路蛋白的表达而发挥调控作用[13]。且miR-29 是T 细胞因子或淋巴样增强因子的负调控分子，通过降解靶基因IFN-γ 的表达能有效降低机体对胞内病原体的免疫应答水平[14]。

而在本研究中，痰菌阳性组和痰菌阴性组的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平比较差异无统计学意义（P>0.05），但痰菌阴性组和痰菌阳性组的miR-29a、IFN-γmRNA 水平均较对照组低，miR-29b、miR-29c 水平均较对照组高，差异均有统计学意义（P<0.05）。一方面，由于IFN-γ 与抗结核感染免疫反应存在密切联系，而无论是痰菌阳性和痰菌阴性的活动性肺结核患者，体内结核菌均呈活动状态，所以其外周血特异抗原的效应T 细胞数量及免疫应答水平均可能类似[15，16]。而本研究结果中痰菌阳性和痰菌阴性肺结核患者IFN-γmRNA 水平差异并不明显，也验证了这一结论。另一方面也说明痰菌阳性和痰菌阴性肺结核患者与健康人群的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平均存在明显差异，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 与肺结核的发生及发展可能存在密切的联系[17]。经ROC 曲线分析结果显示，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 诊断痰菌阴性肺结核的AUC 分别为0.872、0.859、0.864、0.896，这提示miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 在痰菌阴性肺结核的诊断中均有重要的价值，也为结核病的诊断提供了重要的靶标和参考依据。

综上，miR-29 及靶基因IFN-γ 与结核病的发生发展均存在密切联系，测定miR-29a、miR-29b、miR-29c 及靶基因IFN-γmRNA 的表达水平对痰菌阴性肺结核的诊断具有重要价值。