外周血单个核细胞中circTCF25表达水平在肺源性心脏病患者诊断及预后中的应用

王敏 袁博 张一凡 庞咪 潘金

(西安交大医学院附属市九院(西安市第九医院)心血管内科，陕西 西安 710054)

肺源性心脏病(cor pulmonale，CP)是由于慢性肺组织、肺血管病变引起肺血流受限、肺动脉压力增加，从而引起右心室肥厚、扩张，甚至右心功能衰竭[1-2]。近年来研究发现环状RNA(circular RNA，circRNA)在心血管疾病的发生和发展中发挥重要作用[3-4]。circRNA可通过多种机制调控基因表达，其中最重要机制之一是与微小RNA(microRNA，miRNA)竞争性结合，充当“miRNA海绵”，从而调控miRNA的靶基因[5-6]。既往研究[7]指出miRNA-103/107在肺动脉高压血管重塑中发挥重要调控作用，而肺动脉高压作为CP病理生理的中心环节，笔者推测与miRNA-103/107保守结合的circTCF25可能与CP病程密切相关，可能是CP的潜在分子标志物。基于此，本研究通过检测CP患者和健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中circTCF25的表达差异，探讨其对CP诊断和预后预测的价值，旨在为CP诊断和预后预测寻找可靠的分子标志物，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年11月—2018年11月西安市第九医院收治的52例慢性CP患者(CP组)。纳入标准：(1)符合1977年中国肺源性心脏病专业会议制定的诊断标准；(2)年龄>18岁；(3)本研究取得患者知情同意，经医院伦理委员会审批通过。排除标准：(1)合并肿瘤、严重的肝肾疾病或全身代谢性疾病患者；(2)有心肌梗死、肺梗死或脑梗死史者；(3)合并神经系统疾病者；(4)糖尿病、先天性心脏病及其他心血管疾病等。52例CP患者中，女性20例，男性32例；年龄41～74(65.63±6.40)岁；原发疾病：慢性阻塞性肺病41例，特发性肺动脉高压11例。另选取同期性别、年龄与CP组患者相匹配的健康体检者30例作为正常对照组，均排除糖尿病和各种心血管疾病等。两组入院后均完成动脉血氧分压(PaO2)、脑钠肽(BNP)、平均肺动脉压(mPAP)及心脏超声检查；对CP患者随访观察1年，随访以电话及门诊方式进行，记录患者随访期内预后情况。

1.2 方法

1.2.1 外周血分离PBMCs

所有研究对象入院后抽取清晨空腹静脉血5 mL，离心后分离血浆，加入淋巴细胞分离液(达科为生物技术股份有限公司)后，使用梯度离心法提取PBMCs，加入TRIzol试剂(美国Invitrogen)充分裂解后于-80 ℃条件下保存。

1.2.2 circRNA的提取及实时荧光定量聚合酶链反应检测

根据TRIzol试剂盒说明书步骤提取PBMCs总RNA。提取的总RNA以逆转录试剂盒(罗氏)合成cDNA，以GAPDH为内参，采用全自动荧光定量PCR分析仪(罗氏cobas z480)进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测circTCF25相对表达水平。扩增条件：以95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s顺序进行扩增反应；以95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s顺序进行溶解反应。circTCF25相对表达水平采用ΔΔCt法由GAPDH标准化后得到。引物序列由广州吉赛生物有限公司合成，GAPDH-F：5’GGGAAACTGTGGCGT GAT；GAPDH-R：5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA；circ TCF25-F：5’GATACAGCAGGCGCTCACCAT； circTCF 25-R：5’TCGGGTCTGCGGTAATCCA。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组性别、年龄、体质量指数(BMI)比较无显著差异(P>0.05)；CP组PaO2显著低于对照组(P<0.05)，BNP水平显著高于对照组(P<0.05)，右室内径显著大于对照组(P<0.05)，详见表1。

2.2 circTCF25在CP组和对照组PMBCs中的表达水平比较

CP组PMBCs中circTCF25水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 CP组和对照组circTCF25水平比较

2.3 CP患者PMBCs中circTCF25水平与PaO2、BNP的相关性分析

采用Pearson相关分析CP患者circTCF25表达水平与PaO2、BNP的相关性，结果显示circTCF25表达水平与PaO2呈显著负相关(r=0.633，P<0.05)，与BNP水平呈显著正相关(r=0.528，P<0.05)。

2.4 PMBCs中circTCF25表达水平对CP的诊断价值

应用ROC曲线确定circTCF25诊断CP的最佳临界值，取约登指数最大时对应的circTCF25水平作为临界值，结果显示circTCF25诊断CP的最佳截值为1.37，诊断的AUC为0.834(95%CI0.734～0.908)，与AUC=0.5比较，差异有统计学意义(Z=9.219，P<0.001)。见表3、图1。

表3 PMBCs中circTCF25诊断CP的诊断效能

图1 PMBCs中circTCF25诊断CP的ROC曲线

2.5 PMBCs中circTCF25表达水平与CP患者预后的关系

截止随访时间，52例CP患者均获得完整随访，其中全因性死亡8例，占15.38%。根据随访临床结局，将CP患者分为生存组与死亡组，死亡组circTCF25表达水平显著高于生存组(P<0.05)，见表4。应用ROC曲线确定circTCF25预测CP患者预后不良的最佳临界值，取约登指数最大时对应的circTCF25水平作为临界值，结果显示外周血circTCF25预测CP患者预后不良的最佳截值为1.74，预测的AUC为0.722(95%CI0.636～0.798)，与AUC=0.5比较，差异有统计学意义(Z=4.708，P<0.001)。见表5、图2。

表4 不同结局CP患者PMBCs中circTCF25表达水平比较

表5 PMBCs中circTCF25预测CP患者预后的预测效能

图2 PMBCs中circTCF25预测CP患者预后的ROC曲线

3 讨论

随着高通量测序技术的成熟及应用，circRNA被发现与多种人类疾病的发生和发展密切相关，其生物学功能也被越来越多的研究所揭示。众多研究[8-10]发现，circRNA可通过充当miRNA海绵、竞争性结合miRNA与蛋白质结合形成复合体等方式调控基因表达。近来发现，一些循环血的circRNA表达变化与疾病具有密切的关系，可用作疾病早期诊断和预后评估的生物标志物[11]。circRNA的分子结构形似封闭的圆环，无5’端帽子结构和3’端多腺苷酸尾部，因此难以被核酸外切酶降解[12]，也让circRNA作为诊断或预后评估的生物分子标志物成为可能。circRNA的结构特点为较好的稳定性和序列保守性，其与miRNA的相互作用在不同疾病中发挥相似的作用。如果某种miRNA参与CP疾病进程，则与其结合的circRNA同样可能与CP进程有关[13]。既往研究[7]发现miRNA-103/107在肺动脉高压血管重塑中发挥重要调控作用，而肺动脉高压作为CP病理生理的中心环节，因此与miRNA-103/107保守结合的circTCF25可能与CP病程密切相关。

本研究检测了circTCF25在CP患者和健康人PMBCs中的表达水平，结果显示circTCF25表达水平在CP组较对照组明显上调，提示circTCF25可能与CP病程密切相关。CP患者晚期出现心肺功能衰竭时诊断相对容易，但早期诊断仍存在一定难度。肺动脉高压是慢性CP的病理生理的中心环节，如能早期针对CP原发疾病进行干预，或有针对性的对肺动脉压进行控制，有可能逆转疾病进程或右心功能的进一步恶化。因此早诊断、早治疗对改善慢性CP患者预后，提升其生存质量临床意义重大。通过ROC曲线分析，笔者发现circTCF25对CP具有较好的诊断效能，AUC为0.834(95%CI0.734～0.908)，因此circTCF25可能是CP的潜在分子诊断物。

CP患者右心功能受损，入院后行血气分析检查表现为PaO2值明显下降，而静脉血BNP水平显著升高，与既往报道[14]相一致。通过Pearson相关性分析发现circTCF25表达水平与PaO2呈显著负相关，与BNP水平呈显著正相关，说明circTCF25与CP患者病情严重程度存在密切关联。Deng等[7]研究指出miRNA-103/107对肺动脉血管平滑肌增殖具有抑制性调节作用，在低氧诱导的肺动脉高压大鼠，mPAP及右心室收缩压明显升高，右心室及肺血管重构，同时miRNA-103/107表达下调，这与本研究中circTCF25表达上调的结果相一致，因此推测circTCF25可能通过“海绵机制”与miRNA-103/107结合，调控下游靶基因表达的形式参与CP病程，但这一机制及相关信号转导机制有待研究进一步明确。晚期CP患者多预后较差，患者多因右心衰竭致死[15]。本研究通过比较不同临床结局患者circTCF25表达水平发现，死亡组circTCF25水平显著高于生存组，提示高circTCF25表达水平者预后差。通过ROC曲线进一步分析，确定circTCF25预测CP患者预后不良的AUC为0.722(95%CI0.636～0.798)，提示其对CP患者预后具有较好的预测价值。相信随着circRNA在CP发生、发展中的作用机制越来越明确，其作为CP分子标志物的应用价值也会越来越清晰。

综上所述，本研究结果表明PBMCs中circTCF25表达水平在CP患者明显上调，其对CP诊断和预后评估具有较好的应用价值，可能是CP早期诊断和预后预测的潜在分子标志物。本研究不足之处在于样本数量较小，结果有待进一步大样本研究验证。