红菊苣花色素纯化工艺研究及组分分析

2021-11-13孙飞龙宁景叶王凤娟

西安工程大学学报 2021年5期

孙飞龙，宁景叶，王凤娟，原龙，朱琳

(西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安 710048)

0 引言

赤色叶球的红菊苣也称为结球红菊苣和软化白菊苣，是一种食药同源的无公害蔬菜[1]，具有较高的抗氧化活性，有利尿消肿、清肝利胆、健胃解腻等功效[2-3]，可用于预防心血管疾病、癌症和延缓衰老[4-6]。

花色素富含酚类物质，具有保健功效和营养作用，常用于食品着色、衣料染色、化妆品上色及医药等方面[7-9]。花色素在红菊苣中含量丰富，经粗提物提取获得的花色素含有较多的小粉、果胶、卵白和易分解的糖等杂物，影响并限制了花色素的质地和纯度[10-12]。为了提炼优质和杂物少的花色素，提高红菊苣花色素的产量和质量，需对粗提物进行提纯。多孔微球吸附因工艺简单、成本低廉、分离效率高、不和糖类相互作用、洗脱容易等优点在花色素的众多纯化方法中脱颖而出[13-15]。本文采用动静态吸附及解析实验分析多孔微球法纯化红菊苣花色素的最佳工艺，并采用高效液相色谱分析其组成,探究多孔微球对红菊苣花色素的提纯效果。

1 实验

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂新鲜红菊苣(市场所售)；8种型号多孔微球(AB-8、D-280、HPD300、HPD600、X-5、D101、D3520)、聚酰胺(源辰化工材料有限公司)；标准品(矢车菊-3-O-葡萄糖苷，成都曼斯特生物科技有限公司)；氢氧化钠(NaOH,四川西陇试剂有限公司)；盐酸(HCl,天津科密欧化学试剂有限公司)；磷酸氢二钾(K2HPO4，天津科密欧化学试剂有限公司)；柠檬酸(CA，西安百盛化工有限公司)；丙酮(C3H6O,天津科密欧化学试剂有限公司)；无水乙醇(C2H6O,天津广成化学试剂有限公司)；氯化钾(KCl，天津科密欧化学试剂有限公司)；磷酸(H3PO4，天津恒兴化学试剂有限公司)；甲醇(CH3OH,天津科密欧化学试剂有限公司)；以上试剂均为分析纯，无菌水为实验室自制。

1.1.2 仪器超声波清洗机(SK5200LHC，超声仪表上海科导有限公司)；电热恒温水箱(W13-40，天津泰斯特器械有限公司)；真空干燥箱(DJ-IBC，天津泰斯特器械有限公司)；分光光度计(可见光722，上海精密科学仪表有限公司)；电热鼓风干燥箱(DGF-1AB立式，天津泰斯特仪器有限公司)；电子天平(托利多-梅特勒仪器有限公司)；水式循环真空泵(SHA-D，巩义英裕予华仪表厂)；精密酸度计(pH-3C，上海雷磁仪器厂)；涡旋混合仪(XW-80A，上海沪西分析仪器厂)；液相色谱仪(Agilent1200，美国Agilent公司)。

1.2 红菊苣花色素纯化工艺

1.2.1 制备粗提液使用无菌水清洗红菊苣，切成小块，在60 ℃电热鼓风环境下干燥24 h后破碎，经80目筛过滤。称取红菊苣粉末4 g，与体积分数为70% 的酸性乙醇(含0.1%盐酸)在41 mL∶1 g的液固比条件下混匀，在40 kHz、200 W避光条件下超声提取28 min，经减压过滤、浓缩得到粗提花色素液体，置于5 ℃冰箱中备用。

1.2.2 预处理多孔微球脂在体积分数为95%乙醇的液体中浸入多孔微球24 h，当树脂胀大，排空微球中的空气，用无菌水将其反复冲至无异味；再浸入体积分数为5%的HCl溶液中12 h，用流动的无菌水进行清洗；最后在体积分数为5%NaOH液体中浸入12 h，浸毕，用无菌水清洗并调节pH为7，多孔微球中残存的单体化合物和防腐物质经过上述步骤可去掉[16]。

1.2.3 筛选最佳多孔微球真空过滤多孔微球，在250 mL的烧杯中分别放入8种4 g多孔微球，再加入100 mL质量浓度为110.89 mg/mL，pH=2.76未提纯的花色素液体。在恒温振荡器中放入配置好的溶液，在温度25 ℃，速度120 r/min的条件下振荡24 h。浸泡完全后，进行抽滤，用pH示差法计算滤液中所含花色素[17]的吸附率。

8种多孔微球经过真空过滤，分别放4 g于250 mL烧杯中，加入100 mL体积分数为50%的乙醇，振荡24 h，抽滤，测定花色素在滤液中的含量，计算解吸程度[18]。

多孔微球的反应效率：

(1)

(2)

式中：C0为处理前样液中红菊苣花色素质量浓度,mg/mL；C1为处理后滤液中红菊苣花色素质量浓度,mg/mL；C2为滤液解吸后红菊苣花色素质量浓度,mg/mL。

1.2.4 AB-8多孔微球静态实验在150 mL定量瓶中放入8份2 g经前处理的多孔微球，加入50 mL质量浓度为110.89 mg/mL的粗提取液，在恒温振荡器中放入配置好的溶液，在温度25 ℃，速度120 r/min的条件下振荡24 h，每隔0.5 h进行1次抽滤，测得溶液中所含花色素的量。

在150 mL容量瓶中放入6份2 g处理后的树脂，设置好添加样液的pH值梯度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)，在恒温振荡器中放入配置好的溶液，在温度25 ℃、速度120 r/min条件下振荡24 h，待其充分吸入后，再进行抽滤，测得花青素溶解在滤液中的量，计算吸附率。

1.2.5 AB-8多孔微球动态实验 1) 浓度影响。湿法向柱内装入4 g AB-8型多孔微球，分别配制100 mL质量浓度分别为64.87、108.29、153.79、197.21、249.76、304.08、341.33、378.88、432.34 mg/L未提纯的样液，流过柱内速度为2 mL/min，测定流出液中所含花色素的量。

2) 流速影响。湿法向柱内装入4 g AB-8型多孔微球，添加200 mL的未提纯样液，速度梯度分别为1、2、3 mL/min，测出流出液中所含花色素的量并计算吸附率。

3) 流出液体积。湿法向柱内装入4 g AB-8型多孔微球，在柱内以2 mL/min的速度加入吸光值A=1.654的花色素粗提取液，每隔20 min测量获得液的吸光度值A+，A+=A/10开始记录[19]，取5次数据求平均数，得到AB-8多孔微球对花青素动态吸附泄露曲线。

4) 乙醇解吸。湿法向柱内装入AB-8型多孔微球，用无菌水清理，再以2 mL/min的流速对100 mL不同体积分数(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇进行清洗，测得洗脱液所含花色素的量并计算树脂解吸效率。

5) 洗脱影响。湿法在柱内装入AB-8型多孔微球，先用无菌水清洗，再用速度为2 mL/min乙醇(60%)进行洗脱，每收集10 mL解吸液测定吸光值1次，当解吸液吸光值不变时，停止上样。

1.2.6 纯化后色价测定依照GB 6718—86测定红菊苣中花色素色价，称取1 g提纯后的花色素细粉，用pH=3.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂稀释100倍。在520 nm波长下测定吸光值，保证吸光值在0.2～0.6之间，取5次数据求平均数。花青素色价计算公式[20]为

(3)

1.3 红菊苣花色素组分

1.3.1 溶液配置及处理流动相A：过滤甲醇采用0.45 μm微孔滤膜，超声至无气泡。流动相B：磷酸-蒸馏水体积比为0.3∶99.7；进样液。用0.45 μm微孔滤膜过滤红菊苣的花色素提纯液[21]。

1.3.2 色谱条件及程序洗脱步骤采用高效液相色谱法(HPLC)分析红菊苣所含花色素的成分，采用程序洗脱法在0～35 min内，用体积分数为25%的流动相A进行洗脱；在30～50 min内，用体积分数为75%的流动相A进行洗脱；洗脱液体积为10 μL，洗脱流速1 mL/min，将520 nm的波长作为检测波长，设置柱温为40 ℃。

2 结果与分析

2.1 确定多孔微球类型

在花色素中存在多个酚类基团，易与多孔微球中的原子团形成次级键，因此花色素在极性多孔微球中得到的吸收效果较好，但多孔微球表面积也会影响花色素的吸附效果。花色素自身的结构有较强的极性与亲水性，也可选用弱极性的多孔微球。多孔微球筛选结果如图1所示。

图1 多孔微球的筛选Fig.1 Selection of porous microsphere

从图1可以看出，AB-8型多孔微球的吸附效率最高，解吸效率与D280型多孔微球差距较小，因此AB-8型多孔微球为最佳吸附微球，在处理过程中多孔微球中的原子团易与花色素形成次级键。

2.2 AB-8型多孔微球静态实验

2.2.1 确定静态吸附/解吸平衡时间静态吸附/解吸动力曲线如图2所示。

图2 静态吸附/解吸动力曲线图Fig.2 Kinetic curve of static adsorption/desorption

从图2可以看出，吸附率在0.5～1.0 h之间出现较大的波动，吸附率在2.5 h后趋于稳定，多孔微球处于饱和吸附状态，因此2.5 h被视作静态的吸附时间。随时间的增加解吸率也增加，1.5 h后达到稳定，大都在多孔微球中吸附的花色素可以被解吸下来，所以选择1.5 h作为静态解吸时间。

2.2.2 上样液pH对多孔微球吸附效率的影响上样液pH对多孔微球吸附效率的影响如图3所示。

图3 上样液pH对多孔微球吸附率的影响Fig.3 Effect of pH of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

从图3可以看出，在pH=1～2区间内，多孔微球对上样液的作用逐渐平稳；但当pH>2，尤其是在2～3之间时，作用效率迅速下降，因为红菊苣花色素在较强酸性条件下，主要以阳离子的形式存在，易与弱极性的多孔微球相联结，伴随酸性的削减，花色素的存在形式在结构比例上发生变化，干扰花色素与多孔微球的联结，故选用pH=2的样液。

2.3 AB-8型多孔微球动态实验

2.3.1 上样液质量浓度对多孔微球作用的影响上样液质量浓度对多孔微球吸附率的影响如图4所示。

图4 上样液质量浓度对多孔微球吸附率的影响Fig.4 Effect of concentration of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

从图4可以看出，在红菊苣花色素的质量浓度不断增加过程中，多孔微球的作用效果在304.08 mg/L之前平稳上升并在341.33 mg/L达到最高，随后开始减弱。因此太低的花色素含量减弱了多孔微球的作用；太高的花色素含量，使多孔微球吸收无用的杂物，从而干扰花色素流过多孔微球中的速度，导致上样液过早泄露，减弱了多孔微球的作用效果，因此选择质量浓度为341.33 mg/L的样液最佳。

2.3.2 上样液流速对多孔微球吸附率的影响随着上样液流过柱内的速度下降，花色素和多孔微球的交汇时间延迟，效果显著但导致效率衰减，实验周期更长；增大速度会缩短样液和多孔微球的接触时间，效果越差；上样流速对多孔微球吸附率的影响如图5所示。

图5 上样液流速对多孔微球吸附率的影响Fig.5 Effect of flow rate of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

从图5可以看出，随着流出液体积的不断增加，吸附率不断下降，并且上样液的速率越小，吸附率下降越慢，因此越小的上样液流速吸附效果越好，最佳上样液流速为2 mL/min。

2.3.3 花青素泄露曲线测定 AB-8多孔微球对花青素动态吸附泄漏曲线如图6所示。

图6 AB-8多孔微球对花青素动态吸附泄漏曲线Fig.6 Dynamic adsorption-leakage curve of AB-8 porous microsphere for anthocyanins

从图6可以看出，随着流出液体积的增多，流出液的吸光度也呈递增趋势，在流出液体积为260 mL时，吸光度达到0.169，视作泄漏点，所以上样量为260 mL。

2.3.4 乙醇浓度对多孔微球解吸的影响实际上，解吸过程是用一种解吸液使花色素和多孔微球之间的相互作用力减弱。从AB-8微球中分离出花色素，但乙醇溶液浓度不同极性有差别，不同程度地干扰了相互作用力的效果。乙醇体积分数对多孔微球解吸的影响见表1。

表1 乙醇体积分数对多孔微球解吸的影响Tab.1 Effect of ethanol volume fraction on desorption of porous microsphere

从表1可看出，解吸率在乙醇溶液浓度较低时效果较差，乙醇溶液体积分数为60%时效果最好，之后解吸效果开始下降。所以在乙醇体积分数为60%时，最大解吸率为91.45%，因此将体积分数为60%的乙醇溶液作为解吸液。

2.3.5 洗脱曲线测定红菊苣花色素洗脱曲线如图7所示。

图7 红菊苣花色素的洗脱曲线Fig.7 Elution curves of anthocyanidins of chicory red

从图7可以看出，AB-8型多孔微球的洗脱峰较窄，大部分附着在多孔微球上的红菊苣花色素无需用大量解吸液就被解吸。当洗脱剂用量为100 mL时，附着于多孔微球上的花色素几乎全部被解吸，所以选择100 mL体积分数为60%的乙醇作为洗脱液。

2.4 红菊苣花色素定性分析

在最优条件下，选择AB-8型多孔微球进行提纯，测定红菊苣花色素色价从5.3提升至49.1，是未纯化的9.3倍。从颜色判断,提纯后红菊苣的花色素液体表现为血色样，由花色素的种类与颜色进行推断，红菊苣所含的花色素为矢车菊类的花色素。进行HPLC测定后，标准矢车菊-3-O-葡萄糖苷与红菊苣的供试样品色谱图对照如图8所示。

从图8(a)可以看出，标准矢车菊-3-O-葡萄糖苷的出峰时刻为13.539 min；从图8(b)可以看出，红菊苣液体共含6种花色素，花色素的出峰时刻为13.609 min，接近于标准矢车菊-3-O-葡萄糖苷的出峰时刻，可以断定红菊苣中的花色素以矢车菊-3-O-葡萄糖苷为主。