丹酚酸B通过抑制IL-13/STAT6通路和恢复Th17/Treg平衡阻滞大鼠慢性阻塞性肺病研究*

2021-11-13席俊峰

广西医科大学学报 2021年10期

张莉，何达，席俊峰

（陕西榆林市第一医院呼吸内科，榆林 719000）

慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以不完全可逆气流受限，且进行性发展为特征的肺部疾病，其作为世界上第三常见的威胁生命的疾病，与高发病率和高死亡率有关[1-2]。研究数据表明，COPD 的全球疾病负担预计从2003 年第13 位上升到2030 年第5 位，COPD 未来的疾病形势将更趋严重[3]。慢性气道炎症被认为是COPD 持续发展的重要诱因，因此抗炎治疗是COPD 的主要治疗手段[4]。近年来，糖皮质激素以其显著的抗炎作用在COPD的治疗中得到了越来越多的应用。然而，由于皮质类固醇的易耐药性导致其在临床上对COPD 的疗效相当有限[5]。因此，有必要寻找其他有效的抗炎靶点作为治疗COPD潜在的药物研发策略。丹酚酸B是从中草药丹参中提取的主要生物活性成分，其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和免疫调节等作用[6-7]。研究表明，白介素（IL）-4/IL-13 能够通过激活JAK/STAT6 通路，介导过敏性气道上皮杯状细胞化生和黏液高分泌，而气管内滴注IL-13可显著促进STAT6的转录与表达[8]，提示IL-13是STAT6的上游调控因子，且IL-13/STAT6 通路参与调控了COPD 的发生发展。此外，炎症性Th17 细胞与免疫抑制调节性T 细胞（Treg）的失衡是COPD的发病机制之一，恢复Th17/Treg平衡可延缓COPD疾病进展[9]。然而，迄今为止，丹酚酸B 对COPD 的作用及其机制尚未明确，本研究旨在探究丹酚酸B 对COPD 的作用及其可能的机制，以期为开发新的COPD治疗策略提供依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器

6 周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40 只，体质量180～220 g（西安交通大学实验动物中心提供）；丹酚酸B（纯度≥98%，成都格利普生物科技有限公司）；地塞米松（纯度≥98%，美国Sigma 公司）；阿尔辛蓝—过碘酸—雪夫（AB-PAS）染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）；MUC5AC、RORγt、Foxp3、IL-13 和STAT6 抗体（英国Abcam 公司）；Phospho-STAT6（Tyr641）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；GAPDH抗体（北京义翘神州生物技术有限公司）；大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）和白细胞介素17A（IL-17A）ELISA 检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；Ani-Res2005 动物肺功能分析系统（北京贝兰博科技有限公司）；倒置显微镜（日本尼康）；全自动酶标仪（美国BioTek）。

1.2 造模及分组给药

40 只SD 大鼠于动物房饲养，环境温度22～26 ℃，提供充足饮水及饲料。待大鼠适应环境一周后，将其随机分为对照组、模型组、丹酚酸B组和阳性对照组，每组10 只。除对照组外，其余组大鼠采用烟熏联合气管内滴注脂多糖（LPS）法建立慢阻肺大鼠模型[10]。造模组在第1、14 天于大鼠每次持续30 min。对照组气道内注射生理盐水。丹酚酸B组和阳性对照组气道内注射200 μg LPS，在第2～13天和第15～28 天每天给予两次烟熏处理，大鼠在每次烟熏前1 h分别腹腔注射丹酚酸B（50 mg/kg）[11]和地塞米松（0.2 mg/kg）[12]，其余组注射生理盐水，持续给药4周。

1.3 各组大鼠肺功能测定

给药28 d 后，10%水合氯醛麻醉大鼠（3 mL/kg），于颈部切一小口，在气管内插入塑料插管，然后将插管连接到AniRes2005 动物肺功能分析系统（Bestlab，北京）上，测量每分钟通气量（MVV）、用力呼气量（FVC）、0.3 s用力呼气量（FEV0.3）和呼出25%FVC气量时的流速（FEV0.3/FVC%）。

1.4 肺泡灌洗液（BALF）收集

给药28 d 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉幼鼠（0.1 g/kg），暴露肺和气管，结扎右主支气管。插入灌洗管灌洗左肺，收集BALF。

1.5 肺组织湿/干重比（W/D）测定

给药28 d 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉幼鼠（0.1 g/kg），取右上肺，去除肺表面水分和血迹，称重，即为湿重（W）。随后65 ℃恒温箱干燥肺组织，48 h后称重，即为干重（D）。计算各组大鼠W/D值。

1.6 苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色检测大鼠肺组织病理学变化

大鼠肺组织用4%多聚甲醛固定72 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明。石蜡包埋、切片。石蜡切片常规二甲苯、乙醇脱蜡至水，苏木素染色10 min，0.7%盐酸乙醇分化数秒，流水洗涤后，伊红液浸染3 min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。切片于光学显微镜下放大观察分析。按照参考文献[10]中的方法，对肺组织病理学损伤进行评分：0 分，无损伤；1 分，1～25%损伤；2 分，＞25～50%损伤；3 分，＞50～75%损伤。

1.7 AB-PAS染色检测杯状细胞增生

按“1.6”项方法制备肺石蜡切片，脱蜡至水。阿尔辛蓝染液浸染10 min水洗后，0.5%高锰酸水溶液氧化10 min 水洗后，雪夫试剂避光浸染30 min；流水冲洗后，苏木精复染核1 min，盐酸酒精分化，氨水返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，显微镜观察并拍照，用Image Pro Plus6.0 软件测量相应支气管上皮AB-PAS 阳性面积和总面积，按照以下公式计算AB/PAS 阳性率：AB/PAS 阳性率=（AB-PAS阳性面积/总面积）×100%

1.8 免疫组化检测大鼠肺组织MUC5AC表达

肾脏石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2避光孵育15 min，PBS清洗后，5%BSA避光孵育1 h，MUC5AC 一抗稀释液（1:100）4 ℃孵育过夜。二抗稀释液（1:200）避光孵育1 h。DAB 显色液显色，苏木素染液染色5 min。自来水冲洗，1%盐酸酒精溶液分化10 s。0.2%氨水做返蓝处理8 s。自来水冲洗后，切片进行脱水、透明处理，中性树胶封片，光学显微镜观察分析。

1.9 Western blotting 检测MUC5AC、RORγt、Foxp3和IL-13/STAT6通路蛋白表达

将各组大鼠肺组织剪碎，RIPA 裂解液裂解组织，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE分离并转至PVDF 膜上。10%脱脂奶粉封闭，随后加入MUC5AC（1:1 000）、RORγt（1:1 000）、Foxp3（1:1 000）、IL-13（1:1 000）、p-STAT6（1:2 000）、STAT6（1:500）和GAPDH（1:5 000）抗体，4 ℃条件下过夜孵育。加入二抗（1:5 000）室温孵育1 h 后，滴加BeyoECL Star 工作液到膜上，化学发光成像仪检测。

1.10 ELISA 检测TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-10 和IL-17A水平

取大鼠5 mL BALF，4 ℃条件下3 000 rpm 离心10 min，取上清液。根据ELISA 试剂盒说明书检测上清液中TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-10 和IL-17A 水平，酶标仪检测450 nm处吸光度，根据标准曲线，计算各炎性因子水平。

1.11 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均值±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 丹酚酸B 对慢阻肺大鼠肺功能及W/D 比值的影响

与对照组相比，模型组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC和MVV 显著降低（P＜0.05），W/D 比值显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，丹酚酸B 组和阳性对照组大鼠MVV 显著升高（P＜0.05），W/D 比值显著降低（P＜0.05），FEV0.3、FVC 和FEV0.3/ FVC 无显著变化（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠肺功能参数及W/D比值的比较

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

2.2 丹酚酸B 对慢阻肺大鼠肺组织病理学损伤的影响

HE 染色下可见对照组大鼠肺泡结构正常，与对照组（0.78±0.02）相比，模型组大鼠肺泡结构被破坏，伴有明显的肺泡腔内出血，同时肺组织病理学评分显著升高（2.67±0.04，P＜0.05）；与模型组相比，丹酚酸B 组（1.38±0.01）和阳性对照组（1.51±0.02）大鼠肺组织病理学变化明显改善，肺组织病理学评分亦显著降低（P＜0.05）,见图1。

图1 HE染色检测各组大鼠肺组织病理学变化（400×）

2.3 丹酚酸B对慢阻肺大鼠杯状细胞增生的影响

与对照组（0）相比，模型组支气管上皮杯状细胞增多，AB/PAS 阳性率显著升高（17.56±0.84）%，P＜0.05）；与模型组相比，丹酚酸B组（6.89±0.89）%和阳性对照组（5.38±0.83）%大鼠支气管上皮杯状细胞明显减少，AB/PAS阳性率显著降低（P＜0.05），见图2。

2.4 丹酚酸B对慢阻肺大鼠黏液高分泌的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺组织中MUC5AC表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，丹酚酸B组和阳性对照组大鼠MUC5AC 表达显著降低（P＜0.05）,见图3～图4。

图4 各组大鼠肺组织MUC5AC表达

2.5 丹酚酸B对慢阻肺大鼠IL-13/STAT6通路的影响

与对照组相比（IL-13，0.12±0.13；p-STAT6，0.38±0.23），模型组大鼠IL-13（2.61±0.13）和p-STAT6（2.41±0.06）表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，丹酚酸B 组大鼠IL-13（0.82±0.03）和p-STAT6（1.23±0.08）表达显著降低（P＜0.05），与模型组相比，阳性对照组IL-13（0.8±0.02）和p-STAT6（1.21±0.06）表达显著降低（P＜0.05），见图5。

图5 各组大鼠IL-13和p-STAT6表达

2.6 丹酚酸B对慢阻肺大鼠炎性因子水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠TNF-α、TGF-β 和IL-6 水平显著升高（均P＜0.05）；与模型组相比，丹酚酸B 组和阳性对照组大鼠TNF-α、TGF-β 和IL-6水平显著降低（均P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠BALF 中TNF-α、TGF-β和IL-6水平的比较pg/mL，

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

2.7 丹酚酸B对慢阻肺大鼠Th17/Treg平衡的影响

与对照组相比，模型组大鼠RORγt 表达和IL-17A水平显著升高（均P＜0.05），Foxp3表达和IL-10水平显著降低（均P＜0.05）；与模型组相比，丹酚酸B 组和阳性对照组大鼠RORγt 表达和IL-17A 水平显著降低（P＜0.05），Foxp3 表达和IL-10 水平显著升高（P＜0.05），见图6，表3。

表3 各组大鼠BALF 中IL-10和IL-17A水平的比较pg/mL，

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

图6 各组大鼠RORγt和Foxp3表达

3 讨论

已有研究表明，丹酚酸B可促进肺细胞增殖、迁移，并抑制氧化应激诱导的细胞死亡，从而逆转肺泡结构的破坏[13]。本研究结果表明，丹酚酸B 可改善COPD大鼠肺功能及肺组织病理学变化。COPD发病机制复杂，气道黏液高分泌是其重要的病理特征[12]。气道黏液的主要成分是糖蛋白，而这些复杂的糖蛋白主要是在粘蛋白（Mucin，MUC）基因的调控下进行合成。粘蛋白5AC（Mucin5AC，MUC5AC）是气道上皮杯状细胞表达的主要基因之一[14]。香烟烟雾、细菌产物、细胞因子（如IL-13）、趋化因子和中性粒细胞蛋白酶等刺激物均可上调MUC5AC 的表达，进而诱导杯状细胞发生增生或化生[15]。据报道，抑制IL-13的产生可抑制JAK2/STAT6途径活化，进一步抑制哮喘小鼠的MUC5AC 表达和黏液高分泌[16]。本研究结果显示，丹酚酸B 通过抑制IL-13/STAT6通路，进一步抑制了COPD大鼠MUC5AC表达和黏液高分泌，与文献报道的研究结果一致。

CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞（T regulatory cells，Treg）是CD4+T 细胞的另一个亚型，在慢性炎症过程中，通过接触或释放抑制性细胞因子（如IL-10）发挥对其他免疫细胞的负向调控作用[17]。IL-10主要由Tregs 产生，具有抑制促炎细胞因子和趋化因子的分泌及抑制Th17 分化的功能。同时，IL-10参与了Tregs 的分化，长期吸入烟雾的大鼠外周血和BALF 中IL-10 减少，而TGF-β 的变化趋势则相反[18]。Th17被IL-6、IL-1和TNF-α激活分化，产生标志性细胞因子IL-17A；同时，Th17 特异性转录因子RORγt能促进Th17分化与表达[19]。Foxp3是Treg分化所必需的特异性转录因子，IL-10和TGF-β可上调其表达，ROR-γt 可抑制其表达。最近的研究表明，Foxp3 的缺失可抑制Treg 的分化，导致严重的自身免疫和炎症性疾病[20]。在COPD 患者和动物模型中，Treg和Treg相关细胞因子的产生和功能都受到了明显抑制[21]。而鉴于RORγt/Foxp3 介导的高Th17/Treg比值在COPD慢性炎症中起关键作用[22]，本研究进一步探究发现与正常大鼠相比，COPD 大鼠肺组织IL-10 水平及Foxp3 表达均明显降低，TNF-α、TGF-β、IL-6 和IL-17A 水平和ROR-γt 表达明显升高，而丹酚酸B 治疗后可逆转上述变化。提示丹酚酸B 可促进COPD 大鼠Th17/Treg 平衡的恢复。

综上所述，丹酚酸B 通过IL-13/STAT6 抑制COPD 大鼠黏液高分泌，并恢复Th17/Treg 平衡，在COPD中起到保护作用。该研究结果为明确丹酚酸B在COPD中的作用机制及开发新的治疗药物提供了新的理论与实验室基础。