食管癌预后相关的miRNAs研究进展*

2021-11-13兰会华曾江辉黄雪梅

广西医科大学学报 2021年10期

兰会华，曾江辉，黄雪梅

（1.广西壮族自治区人民医院精准联合检验中心，南宁 530021；2.广西南宁市第二人民医院检验科，南宁 530031；3.广西壮族自治区人民医院药物临床试验机构办公室，南宁 530021）

食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内发病率高居第6位，死亡率居第7位，我国男性食管癌的预计发病例数占全球所有男性食管癌的53.6%[1]。目前食管癌临床治疗仍以手术、放疗及化疗等综合治疗为主，5年生存率不到10%[2]，该疾病的高死亡率是患者面临的主要挑战，如何提高治疗效果是临床工作的当务之急，随着DNA测序和药物基因组学等方面的研究进展，基于生物标志物检测的个体化治疗逐渐成为一种趋势。

MicroRNAs(miRNAs)存在于真核生物中，是一类可调控基因表达的内源性非编码单链小分子RNA，研究证实miRNAs在癌症的发生、进展和治疗中起着重要的作用，可作为多种肿瘤患者特异性生物标志物[3]。与食管癌相关的miRNAs 标志物研究逐年增多，本综述基于大量文献突出具有前瞻性的研究，根据食管癌中miRNA的表达差异与生存期的关系，分析其作为预后生物标志物和确定新的药物靶点的潜力。

1 miRNAs 的基本生物学特性

miRNAs 是一种内源性的非编码RNA，其长度约为22～24个核苷酸[4]。许多生理过程和疾病的发生发展，包括癌症、心血管和代谢性疾病，都高度依赖于miRNAs 的调控。miRNAs 主要通过抑制信使RNA（mRNA）翻译或促进mRNA降解，从而调控基因转录后水平的表达，多数miRNAs 以不完全互补方式与其靶向mRNA 的3’UTR 区（3’untranslated region）结合，从而阻碍对该mRNA的翻译来调控基因表达，但不影响mRNA 的稳定性。此外，还存在其他的调节机制，包括遗传多态性、miRNA 启动子的甲基化、不对称miRNA链选择、与RNA结合蛋白（RBPs）或其他编码/非编码RNA 的相互作用等，多种调节机制不仅调控它们的表达，还影响它们的活性和/或生物利用度[5]。

miRNA 通过作用于靶向mRNA 促使其降解或抑制其翻译，从而调节原癌基因、癌基因或肿瘤抑制因子等靶基因的表达，如具有抑制癌基因功能的miRNA表达降低可导致癌基因的过表达，而具有抑制抑癌基因功能的miRNA 过表达可导致抑癌基因表达降低，致癌基因的过表达或抑癌基因表达降低均可促进肿瘤的发生发展。

2 食管癌中调控异常的miRNAs 及其有效靶点

食管癌主要有两种类型：食管鳞状细胞癌（ESCC）和腺癌（EAC），目前临床上ESCC 占据95%，因此大量研究的主要组织学类型为ESCC。随着DNA测序的发展，在过去的十年中已经发现了成千上万的miRNAs，而miRNA与其靶基因之间的互补性不完全，每个miRNA 可以靶向数百个靶基因，并且特定的基因可以被多个miRNA 靶向。当前面临最具挑战性的问题是miRNA靶标的识别和实验验证，在此，我们总结了在食管癌中调控异常并被验证具备有效靶点的miRNAs，见表1。调控异常的miRNAs可下调或上调靶基因的表达水平，进而影响细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡来促进癌变，到目前为止，已发现大量miRNAs 的表达发生了显著的改变，其中一些miRNAs 通过抑制抑癌靶基因发挥致癌的作用，另一些miRNAs 通过下调致癌靶基因表现出肿瘤抑制特性。miRNAs通过各种途径对肿瘤细胞的增殖与凋亡，生长与迁移等生物学行为进行调控，参与肿瘤的发生、发展和转移，从而影响肿瘤患者的预后。

表1 在食管癌中调控异常的miRNAs及其有效靶点

3 与食管癌预后相关的miRNAs

虽然与食管癌相关的miRNAs标志物研究逐年增多，但多处于基础研究阶段，本综述基于大量文献突出具有前瞻性的研究，根据食管癌中miRNA的表达差异与生存期的关系，分析该miRNA作为判断食管癌预后标志物的效力。我们归纳总结了与食管癌预后相关的miRNAs 及其预后判断指标，包括总生存期(overall Survival,OS)，无病生存期（disease free survival,DFS）或无进展生存期（progress Free Survival,PFS），采用多变量分析对比miRNA高表达组和低表达组的生存时间，用优势比（odds ratio,OR）、风险比值（hazard ratio,HR）、相对危险度（relative risk,RR）、95%置信区间（confidence interval,95%CI）和P值等进行描述，见表2。

表2 与食管癌预后相关的miRNAs

3.1 miRNAs作为食管癌的独立预后因素

3.1.1 miR-146a的上调预示ESCC预后良好

miR-146a被证明能够直接调控肿瘤的关键致癌靶点，如VEGF、Notch 或其他基因位点[16]。有研究采用侵袭实验表明miR-146a-抑制剂可使食管癌细胞侵袭能力增加，在食管癌中miR-146a低表达会导致细胞增殖的增加和细胞凋亡的减少。分析miR-146a 在组织或血清样本中的表达水平与临床病理因素之间的关系，发现血清miR-146a水平具有较高的敏感性和特异性，可以作为ESCC 诊断的一种良好的非侵入性生物标志物。此外，通过比较肿瘤组织与正常组织中miR-146a 的表达差异及患者的生存时间，分析miR-146a在判断食管癌患者预后中的价值，Kaplan-Meier 曲线显示，其下调水平与OS 和PFS 呈负相关关系，进一步的单变量和多变量分析发现miR-146a 是ESCC 中OS 和PFS 的独立预后因子，T期、N期和适当的治疗也与OS或PFS有关[31]。

3.1.2 miR-655的上调预示ESCC预后良好 ZEB1和TGFBR2 是TGF-b 信号通路的重要组成部分，被认为是miR-655 的直接靶标，这表明通过对miR-655的异常下调激活TGF-b-ZEB1-e-cadherin轴可能会加速癌症的进展。研究结果显示，上皮细胞间质化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的抑制剂通过miR-655 靶向作用于ZEB1 和TGFBR2 可能是癌症的预后良好的标志和治疗有效的预兆[38]。Kiuchi 等[14]的研究同样证实，在食管癌中miR-655 的表达水平与较好的预后有显著的相关性，miR-655 表达水平低是淋巴转移的独立危险因素和预后较差的因素。

3.1.3 miR-625 的下调预示ESCC 预后不良 Li等[17]发现miR-625与食管癌的肿瘤深度、分期、转移有关，通过qRT-PCR 检测169 对ESCC 和癌旁组织的miR-625表达水平，发现在ESCC组织中miR-625的表达水平明显低于癌旁组织；通过K-M生存曲线和log-rank 检验进行比较，发现miR-625 低表达的ESCC 患者总生存率低于miR-625 高表达的患者。低表达组5年总体生存率低于高表达组(P=0.001)，提示miR-625下调可能是预测ESCC患者肿瘤进展和预后不良的新型分子标记物。

3.1.4 miR-335 低表达提示ESCC 预后不良研究显示，ESCC标本中miR-335的表达明显低于正常食管组织，miR-335的表达水平与组织学分级、淋巴结转移、肿瘤分期、和临床分期有显著的相关性，miR-335 可作为一个独立的预后因子，其高表达有利于患者生存。经过5年的随访调查，结果显示miR-335在ESCC 中下调与患者总生存期密切相关，在肿瘤组织中miR-335表达较低的患者的总体生存率比高表达的患者更差，证明了在ESCC 中miR-335 表达的减少可能与差的预后相关[18]。

3.1.5 miR-506 的上调提示ESCC 预后不良 miR-506 是肿瘤发生的重要调控因子，研究表明通过绑定目标mRNA，miR-506抑制靶基因的表达，参与调节和控制凋亡、周期阻滞、分化、EMT、细胞转移以及肿瘤的发生和发展的过程。Li 等[25]的研究发现，在食管癌中miR-506 高度表达，miR-506 可直接与细胞周期素依赖性激酶4/6(CDK 4/6)结合，然后与cyclinD 结合，刺激细胞周期从G1 期到S 期，此外，ets1蛋白是miR-506的重要靶点，ets1和miR-506的结合可能进一步影响食管癌血管生成，促进ESCC肿瘤细胞的生长、增殖和侵袭。根据ESCC 患者的长期随访显示，与miR-506 低表达的ESCC 患者相比，miR-506高表达的患者生存率较低，多因素回归分析显示，miR-506的高表达是预测ESCC患者预后不良的重要独立指标。

3.1.6 miR-16上调提示ESCC预后不良 Li等[26]的研究发现，miR-16 的过表达与细胞生长、迁移和侵袭、细胞周期调控的丧失以及细胞凋亡的减少有关，这一调控是通过下调靶基因基质金属蛋白酶-9(MMP9)、维甲酸受体β2 (RAR-β2)和含有Kazal 基序的富含半胱氨酸的反转录蛋白(RECK)来实现的。此外，在ESCC 中，血浆中miR-16 的高表达与明显减少的PFS 和OS 显著相关。研究还发现，miR-16 的血浆水平不仅在早期检测中表现出令人满意的诊断性能，而且对于接受放射治疗的ESCC患者来说，是一种有用的血液预后生物标志物[7]。

3.1.7 miR-191 上调预示ESCC 预后不良有报道称，MDM4作为一种癌蛋白，通过负调控P53的功能在P53抑癌通路中发挥关键作用，定位于MDM4 非翻译区的rs4245739 A＞C多态性作用于miR-191靶位点，导致MDM4表达降低。为了研究这种多态性与患ESCC的风险及其在体内的生物学功能之间的关系，用食道组织检测基因多态性对MDM4表达的影响，对来自中国两个地区的1 128例ESCC病例和1 150 例对照的两组独立病例-对照进行基因型测定，结果表明，MDM4 rs4245739 多态性有助于ESCC 的易感性，并支持了一种假设，即基因变异，中断miRNA 介导的基因调控，可能会改变癌症的风险[23]。另一研究表明，miR-191 可能通过绑定EGR1mRNA 的3’UTR 减少EGR1 表达参与ESCC的进展，作为转录因子，EGR1参与肿瘤的发生和发展，并发挥抑癌作用，进一步研究证实EGR1下调促进了ESCC 细胞的生长和侵袭[35]。多变量Cox 回归分析表明，miR-191在ESCC组织中过表达与晚期临床分期、转移和ESCC 存活率低有关，miR-191 的上调是ESCC患者生存率低的独立预后因素。为了进一步探讨miR-191在ESCC中的预后价值，采用Kaplan-Meier 分析和log-rank 检验观察miR-191 与总生存率的关系，发现在食管癌中，miR-191高表达组较低表达组存活时间短，预后差。

3.2 miRNAs联合检测在食管癌预后评估中的作用

3.2.1 miR-21/miR-375 联合检测在食管癌预后评估中的作用一项探讨血浆miR-21 在ESCC 患者中的诊断价值的研究发现，miR-21是食管癌患者的独立预后因素，可作为预测ESCC 放化疗疗效和3年生存率的有效生物标志物[33]。miR-21 上调提示食管鳞癌预后不良，使用miRNA-21 在化疗的风险分层和预测总生存期方面具有重要的临床意义[39]。此外，miR-21 过表达患者的复发概率也明显高于miR-21 低表达患者，证明miR-21 作为监测食管癌复发的敏感标志物的有效力[40]。

另一项研究[41]发现，在食管癌患者的组织和血清样本中，miR-21表达水平显著升高，miR-375则下调，这两种miRNAs的表达与浸润深度、TNM分期、血管浸润、淋巴结转移都相关，表明miR-21和miR-375 在食管癌患者中均异常表达，是影响食管癌预后的独立因素。进一步研究发现血浆中miR-21 高浓度组术后生存率明显低于低浓度组，血浆miR-375 高表达组生存率优于低表达组，血浆miR-21 高水平和miR-375低水平的患者预后明显更差。ROC分析表明联合检测miR-21 和miR-375 的诊断价值高于miR-21或miR-375的单次检测，联合检测可作为ESCC的诊断以及反映肿瘤的动态变化及预后效果的标志物。

3.2.2 miR-21/miR-93 联合检测在食管癌预后评估中的作用最近的研究表明，miR-93-5p 可能通过PTEN/PI3K/Akt通路影响PTEN下游蛋白p21和cyclin D1 的表达，促进受体细胞增殖。miR-93-5p 在食管癌患者血浆中的表达是对照组的1.39倍，采用logistic回归分析发现血浆miR-93-5p表达上调显著增加食管病变的风险，miR-93-5p 的过表达与不良的预后显著相关，表明miR-93-5p 可作为食管癌诊断及预后判断的生物标志物[42]。

Wang等[37]的研究发现，在食管癌患者的血清样本中，miR-21和miR-93的表达水平显著升高，两者的表达均与患者的TNM 分期密切相关，miR-21 和miR-93在ESCC患者中高表达可能提示由于肿瘤的转移而导致的更差的预后。进一步的研究发现，放化疗后miR-21 和miR-93 的表达明显降低，提示观察miR-21和miR-93的变化可用于预测患者放化疗的疗效。经过对ESCC 患者进行3 年的追踪回访，发现其3年OS为37.50%，miR-21联合miR-93检测的AUC 用于评估ESCC 患者放化疗的疗效为0.894。Cox回归分析显示，患者高T期、N期、M期、高miR-21(＞5.60)和miR-93(＞3.87)的表达增加了死亡风险，患者miR-21和miR-93的高表达预示ESCC 患者治疗无效的风险增加，表明miR-21 和miR-93联合检测可作为判断ESCC患者预后的生物标志物。