支气管哮喘的全基因组关联分析研究进展*

李海丽，孙 艳，邓静敏△

（1.广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，南宁 530021；2.贵州省贵阳市第一人民医院，贵阳 550002）

支气管哮喘（Asthma，简称哮喘）是多基因遗传的复杂疾病。到目前为止，已有大量的文献报道与哮喘发病相关的人类染色体区域及哮喘易感基因。全基因组关联分析（genome-wide association studies，GWAS）是以单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNP）为标记、鉴定与复杂人类性状和疾病风险相关的遗传变异、探究疾病遗传机制的方法。GWAS 已鉴定出与数百种复杂疾病和特征相关的数千个基因座，并且在阐明这些关联的因果变体和基因方面正在取得进展[1]。其在哮喘遗传机制研究中的应用也越来越广泛。

GWAS 问世前，连锁分析方法最常被用于鉴定疾病的易感基因，而后随着“人类基因组计划”和“人类基因组单体型图计划”的完成以及基因分型技术的广泛应用，GWAS 已逐步取代传统的遗传学研究方法成为研究复杂遗传性疾病的主流。GWAS 的优势在于无需对特定基因预先进行假设，且基因变异检测效率高，其不便之处在于，它们需要大样本量和用于处理大量数据的工具，在处理如此大量的数据过程中需要使用极其严格的检验水准以防止出现假阳或假阴性结果。

哮喘GWAS 研究大部分为基于无关个体的关联分析且多采用病例对照研究设计，部分研究采用基于家系的关联研究。全球首个针对哮喘的GWAS 研究发现，17q12-q21 染色体上ORMDL3 基因rs7216389 位点与儿童哮喘存在强相关性，这一发现在欧洲独立人群以及其他种族中也得到了一致的重复。因此，可以认为17q21 号染色体是一个真正的哮喘易感性位点。迄今为止，全球范围内已经进行了许多关于哮喘的GWAS 研究，不同地域、种族、年龄、性别的易感基因及阳性位点相继被报道出来，现将近年来该领域的相关研究发现综述如下。

1 哮喘GWAS 阳性位点在基因中的分布概况

GWAS阳性位点多位于基因编码区。如17q12-q21 染色体上ORMDL3 基因rs12603332、rs4378650位点，GSDMB基因rs7216389位点等是位于基因编码区中与哮喘相关的SNP阳性位点。然而，越来越多的研究证实，GWAS 阳性位点亦可出现在侧翼序列、基因间等非编码区。如AGT、DPP10、IKBKAP以及IL12RB1 等基因的编码区与哮喘发病几乎无关联，而侧翼非编码区的罕见位点突变与非裔美国人群哮喘易感性显著相关，其中IL12RB1基因侧翼非编码区的非同义突变与非、欧裔美国人群哮喘易感性均显著相关。Th17 细胞系中IL-17A 基因间SNP rs1892280 和rs10807439 是过敏性鼻炎患者的保护或风险因素，白介素（IL）-17F 基因间SNP rs13192563是过敏性鼻炎合并哮喘患者的保护或风险因素。

2 目前哮喘易感基因GWAS 阳性位点研究进展

以“genome-wide association studies或GWAS或polymorphism”并“asthma”为条件在PubMed 外文数据库中检索与哮喘相关的GWAS 研究，共获得2233 条结果，同时，以“全基因组关联性分析或GWAS或基因多态性”并“哮喘”为筛选条件在中国知网上检索相关研究共获得504条结果，包括HLADRB1（6p21.32）、ORMDL3（17q12-q21）、ADAM33（20p13）、IL-13（5q31.1）等在内的多个易感基因及SNP 位点相继在不同人群中得到复制。笔者将从以下4个方面来阐述哮喘易感基因GWAS阳性位点研究进展。

2.1 高Th2型免疫通路相关基因

高Th2免疫通路涉及IL-4、IL-5等细胞因子，其中IL-4 作为经典的细胞因子在哮喘的发病中发挥着不可忽视的作用。研究发现，在白人和非裔美国人中，IL-4基因启动子区的C-589T位点的T等位基因频率存在显著差异（分别为0.183 和0.544），且T等位基因的数量与FEV1值显著负相关（P=0.035），结果表明，非裔美国人（47.2%受试者的FEV1＜50%的预测值））哮喘严重程度高于白人（36.4%受试者FEV1＜50%的预测值）。另有研究证实，IL-4R 基因突变位点Q576R 与I75V 共存时可上调IL-4R 的表达，增加IL-4R 对IL-4 的敏感性，加重气道炎症。而在对日本成年女性进行的一项病例—对照研究显示，IL-4 基因rs2243290 位点的AC 基因型可降低哮喘的发病风险，是哮喘的一个保护因素[2]。

IL-33与生长刺激表达基因2蛋白（ST2）结合可活化MAPKs 和NF-KB，并且诱导Th2 效应细胞因子IL-13、IL-4、IL-5 等的释放，在哮喘的Th2 型炎症反应过程中起关键作用，IL-33 与ST2 分别由IL-33基因、IL1RL1 基因编码。Gudbjartsson 等[3]对9 392名冰岛人血液DNA 进行全基因组关联扫描，并对SNP 进行分型，筛选出显著差异的位点，并对这些位点在来自不同国家的人群（美国、瑞典、澳大利亚、德国、意大利、荷兰、英国、韩国）中进行复制，结果显示，在这些人群中IL1RL1 上的rs1420101 为哮喘风险等位基因（P=5.3×10-14），且与血液嗜酸性粒细胞计数呈正相关关系。此外，该位点与IL1RL1上的另外两个SNP位点rs1921622、rs17026974在日本人群中均被证实与稳定期成人哮喘呼出气一氧化氮及嗜酸性粒细胞水平升高相关[4]。而针对4～8岁荷兰儿童的GWAS 研究表明，IL1RL1 上的rs1420101仅与嗜酸性粒细胞水平升高相关[5]。另一项以欧洲人群为研究对象的GWAS 研究证实，IL1RL1 上另一个位点rs13408661 为哮喘相关阳性位点（P=1.1×10-9)，而rs1420101（P=9.9×10-5）未能达到检验标准（P＜5×10-8）[6]。rs928413 是在丹麦儿童病例—对照研究中发现的IL-33基因另一个哮喘阳性位点，在中国人群中亦得到复制[7]，而在美洲印第安人群儿童（6～17 岁）中被证实与哮喘发病风险不存在相关性[8]。综上，不同种族人群、性别、年龄中同一个位点的重复结果不尽相同，因此对不同的人群进行同一位点的验证十分必要。

IL-13 是IL-33 的下游因子，参与高Th2 型免疫通路介导的气道炎症反应，不仅与嗜酸细胞等的募集、肥大细胞的活化有关还可以诱导气道高反应、参与气道重构，是哮喘发病的重要炎症因子。IL-13基因上的rs1295686 为哮喘风险位点但与血清IgE水平无关联，而该基因上的另一位点rs20541 则相反，仅与IgE 水平相关，与患哮喘风险无关联，可见同一基因上不同SNP 对表型的调控作用可能有所不同。随后rs1295686和rs20541在亚洲和沙特阿拉伯人群中也得到复制，均被证实为哮喘发病的高风险因素[9]。rs20541在芬兰人群中也得到验证[10]。

胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）在由Th2 细胞介导的与哮喘相关的病理生理中起重要作用。早在2009年TSLP基因上的rs1837253 位点已被证实为哮喘和气道高反应性的保护因素。然而，针对日本人群进行该位点的复制研究显示，rs1837253 为哮喘患病的风险因素，同年，Torgerson 等[11]的研究也表明，rs1837253 为欧洲、西班牙、非洲这3 个人群的哮喘易感位点。此外，国内的一项病例对照研究也证实了该位点是中国广西壮族人群哮喘发病的高风险因素。另一个位于TSLP 基因上与哮喘风险相关的阳性位点为rs3806933，该位点可通过加强（AP）-1 与基因调控元件之间的连接以调控TSLP 基因的表达，从而增强人支气管上皮细胞中TSLP 对聚肌胞苷酸poly(I:C)的反应，诱导过敏性炎症的产生增加哮喘患病风险。

2.2 人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相关基因

HLA 基因具有高度多态性，其中HLA-II 类基因参与机体过敏反应的抗原递呈过程，其多态性与花粉、尘螨等特异性IgE 的产生相关。目前GWAS Catalog中与HLA基因相关的阳性位点共111个，其中rs9500927（P=4×10-9）、rs9275698（P=5×10-12）、rs7775228（P=5×10-12）、rs3129890（P=5×10-13）4 个位点已被证实为日本人群的哮喘发作风险因素，而rs9273349（P=7×10-14）是唯一在成人和儿童中都得到验证的位点[12]。此外，位于HLA-DPA1 和HLADPB1之间的SNP rs987870与日本和韩国两个人群的小儿哮喘发病率升高密切相关[P（合并）=2.3×10-10]，而与屋尘螨特异性IgE 水平无关联。rs9273373 是位于HLA 附近的另一个阳性位点，对欧洲人群进行的一项病例对照研究证实，该位点为哮喘合并过敏性鼻炎发病的高风险因素，而与单个表型发病的相关性较低[13]。此外，位于HLA-DPB1基因上的rs1042151（Met105Val）位点在韩国人群中被证实与阿司匹林哮喘易感性相关性最高（P=5.11×10-7），并且该阳性位点可上调HLA-DPB1的表达量，其与阿司匹林刺激后的FEV1 呈负相关关系，为韩国人群阿司匹林哮喘的一个风险因素[14]。

嗜乳脂蛋白样-2（Butyrophilin-like 2，BTNL2）是近年发现的与B7 家族同源的分子，位于6p21 上HLA-Ⅱ和HLA-Ⅲ区域交界处，是一种T 细胞抑制分子，可向T细胞提供抑制信号，并在多种炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用[15]。在日本人群中进行的一项GWAS和复制研究，结果鉴定了几个与成人哮喘易感性相关候选位点，其中3 个GWAS 阳性突变位点rs404860（风险等位基因A）、rs3117098（风险等位基因G）和rs7775228（风险等位基因A），分别位于NOTCH4 基因、BTNL2 基因、HLA-DQA2 基因，均为炎症相关基因。而国内对广西壮族人群进行的复制研究仅证实rs3117098 可能是中国壮族哮喘的危险因素，未能重复GWAS确定的rs404860和rs7775228与壮族人群哮喘的关联[16]。

2.3 将哮喘患者分层的GWAS研究

一项国际多中心GWAS 研究首次对哮喘患者进行分层研究，该研究将患者按照不同特征分为儿童哮喘、迟发型哮喘、职业性哮喘和严重型哮喘亚组，并将不同亚组、血清IgE 水平以及GWAS 位点（分别位于IL1RL1/IL18R1、HLA-DQ、IL33、SMAD3、ORMDL3、GSDMB、GSDMA、IL2RB、SLC22A5、IL13、RORA 基因上或其附近）进行相关性分析[17]。结果显示，rs9273349、rs2284033 位点分别与儿童哮喘亚组、迟发型哮喘亚组以及儿童联合迟发型哮喘亚组发病密切相关，是上述3 种表型发病的高风险位点，而rs3771166、rs1342326、rs744910、rs2305480、rs3894194 阳性位点仅增加儿童联合迟发型哮喘亚组的哮喘发病风险（P≤7.2×10-8），达GWAS 检验水平。另外，剩余3 个位点rs2073643、rs1295686、rs11071559 虽被证实与哮喘易感性有关联，但未达GWAS 检验水平（P＜5×10-7）。该研究亦发现部分位点，如rs9271300，虽与哮喘发病无显著性相关，但与患者血清IgE水平存在关联，该位点在不同国家、民族均得到重复验证。此后，研究者们发现越来越多的与哮喘发病相关的新基因和新位点。我们的研究结果亦表明，TSLP 基因上rs1837253 位点、BTNL2基因上rs3117098位点属于中国广西壮族人群哮喘患病的危险因素[11,16]，而ADAM33基因上S2（rs528557）位点属于保护性因素，与降低壮族人群患哮喘风险相关[18]。

2.4 哮喘急性加重相关易感基因

尽管GWAS 已经鉴定出了多个与哮喘发病相关的易感基因座，但目前对于哮喘急性发作的遗传决定因素研究尚有限。2014 年，Bonnelykke 等[19]对丹麦哮喘儿童（2～6岁）进行的一项GWAS研究证实CDHR3 是哮喘恶化的易感性基因。2015 年，Michael 等[20]对两个非西班牙裔白人哮喘儿童队列组合进行的GWAS研究证实，CTNNA3基因内含子区域中的rs7915695（P=2.19×10-8）、rs7923078（P=3.02×10-8）、rs7923279（P=3.34×10-8）和rs6480203（P=3.79×10-8）位点与哮喘急性加重显著相关是致哮喘急性加重的高风险因素。2020 年，Yan 等[21]针对拉丁裔儿童和青少年进行的一项荟萃分析表明位于14q23.2 号染色体上 的FLJ22447 基因rs2253681 位点与重症哮喘患者急性发作显著相关（P=6.3×10-9），可显著增加重症哮喘恶化的概率。

3 GWAS 的局限性及展望

哮喘是一种复杂的异质性疾病，是遗传和环境因素交互作用的结果。关于哮喘的GWAS 研究涉及不同民族、性别、年龄，通过全基因组扫描，SNP分型已经鉴定了大量的易感基因座及阳性位点。然而，现有的GWAS研究大都专注于探索SNP位点与疾病易感性之间的相关性，而在某种程度上忽视了基因缺失、拷贝数变异、串联重复序列等其他变异。此外，经研究鉴定的阳性SNP位点只能解释疾病复杂遗传性的小部分，其与疾病的发生与转归不一定存在因果关系。最后，由于不同人群间等位基因频率的差别以及连锁不平衡导致了GWAS 结果的多样性，同一个位点需要在不同的人群中重复，而样本量少常导致重复率低或结果出现假阳性及假阴性。那么，对于阴性的GWAS结果是否有必要在不同的人群中进行重复验证，检验水准应该取多大范围等这些问题均值得我们进一步探索。

尽管GWAS目前还存在一些局限性，但不可否认的是它为探索哮喘遗传学机制提供了一种新方法，经GWAS验证得到的易感基因及SNP位点也为哮喘遗传学机制的深入研究提供了新的检测指标。然而，这些检测指标的在哮喘诊治和评估预后方面的有效性及安全性需要进一步的实验验证，这将是未来GWAS领域研究的热点和难点。