自噬在肝癌SMMC-7721细胞DNA放射损伤修复中的影响*

张华颖，刘 鑫，宋秋露，韦可璇，林春香，赵 伟△

（广西医科大学附属武鸣医院 1.放疗科；2.消化内科,南宁 530000）

原发性肝癌（肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一，其在我国的发病例数超过世界总例数的50%[1]。放射治疗是中、晚期肝癌患者有效的治疗方式之一[2-3]。然而，放射抗拒严重影响了肝癌放射治疗的效果。因此，提高肝癌放射治疗的敏感性，对提高肝癌的治疗效果有重要的临床意义。DNA 是放射治疗的靶点，放射治疗可导致DNA损伤并诱导肿瘤细胞凋亡[4]。自噬与肿瘤的发生发展和放射抗拒密切相关[5-6]。但自噬在肝癌细胞DNA 放射损伤反应中的作用及影响目前仍未阐明。因此，本研究以肝癌SMMC-7721 细胞作为研究对象，检测电离辐射（ionizing radiation，IR）后细胞DNA 损伤情况，观察激活和抑制自噬对SMMC-7721 细胞DNA 损伤修复的影响，为提高肝癌放射敏感性提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人肝癌SMMC-7721细胞购自中南大学湘雅医学院。彗星电泳法检测细胞损伤试剂盒（KGA240-50）购自凯基生物公司；自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin）购买于美国Sigma公司；自噬抑制剂3-甲基腺（3-MA）购买于上海爱必信生物公司；微管相关蛋白Ⅰ轻链3（LC3）B 抗体、丝氨酸139 磷酸化形式的组蛋白（γ-H2AX）抗体购自美国Abcam 公司；BCA 定量测蛋白浓度试剂盒、RIPA裂解液、GAPDH、山羊抗兔lgG（H+L）和驴抗兔lgG(H+L)均购自上海碧云天公司；β-actin 购自美国Santa Cruz 公司；DMEM（10566016）高糖培养基、FBS（A3161001）购自美国GIBCO公司；青霉素和链霉素混合液和PBS 缓冲液购自北京Solarbio 公司；ECL发光试剂盒（34577）购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 细胞培养与处理 用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素混合液的DMEM 高糖培养基培养肝癌SMMC-7721 细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，隔天换液。待细胞汇合度达到70%时，将细胞分为4组，即对照（NC）组、单纯照射（IR）组、IR+自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin）组和IR+自噬抑制剂三甲基腺嘌呤（3-MA）组。IR 组SMMC-7721 细胞用不同剂量X 射线（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy）照射不同时间（24 h、48 h）。IR+Rapamycin 组和IR+3-MA 组分别 用20 nmol/L Rapamycin、8 mmol/L 3-MA 处理细胞，6 h后用8 Gy X射线照射细胞。

1.3 彗星实验检测DNA 损伤 将100 μL 1%正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，置于4 ℃下10 min使NMA凝固；将细胞（105个）与75 μL 0.75%低熔点胶（LMA）混合均匀，置于4 ℃下10 min 使LMA凝固。第二层胶凝固后滴加75 μL的LMA，盖上盖玻片4 ℃下凝固30 min。将玻片放入预冷的Lysis Buffer，裂解细胞2 h。载玻片在电泳液(300 mmol/L NaOH、1 mmol/L EDTA)中解旋20 min。调节电流300 mA，电压25 V，电泳20 min。将载玻片放入PBS 缓冲液（pH 7.2～7.4）中，30 min后PI 染色10 min，用荧光显微镜观察细胞，每张玻片随机选取至少50个拖尾细胞，用CASP软件测量Olive尾距。

1.4 Western blotting 法检测细胞γ-H2AX 和LC3B蛋白表达 取NC组和IR组细胞，用RIPA液裂解细胞，离心收集蛋白，测定蛋白浓度，用SDS-PAGE 电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF 膜上，TBST 洗膜3 次，室温封闭20 min，加入一抗LC3B(1:2 000)、γ-H2AX(1:2 000)、β-actin(1:1 000)、GAPDH (1:1 000)4 ℃孵育过夜，加入二抗（1:1 000）室温孵育1 h，使用增强化学发试剂（ECL）显色。用Image J 软件分析蛋白相对表达量。

1.5 免疫荧光检测γ-H2AX和LC3B蛋白表达 除去培养基，PBS 洗3 次，加入4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS 洗3 次，用免疫封闭液封闭1 h。孵育相应一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，37 ℃孵育荧光二抗1 h，再用DAPI 染细胞核5 min。在EVOS FL自动显微镜下观察细胞LC3B蛋白绿色免疫荧光标记的面积和γ-H2AX 蛋白红色荧光焦点数。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 照射对肝癌SMMC-7721细胞DNA的影响 Western blotting结果显示，SMMC-7721细胞照射组与未照射（0 Gy）组相比，γ-H2AX 蛋白表达上调，随着照射剂量增加，γ-H2AX蛋白表达呈升高趋势，在10 Gy时γ-H2AX蛋白表达最高，DNA损伤最为严重（P＜0.05）（图1A）；彗星实验显示，IR 组与NC 组相比较DNA 损伤Olive 尾距增加（P＜0.05），见图1B。

图1 照射对SMMC-7721细胞DNA的影响

2.2 照射对肝癌SMMC-7721细胞自噬的影响 Western blotting 结果显示，随着照射时间和剂量的增加，IR 组LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值增加，但照射剂量超过6 Gy后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低（图2A）；免疫荧光分析结果显示，与NC 组相比，IR 组LC3B标记的荧光斑点数随着照射时间延长明显增加，48 h尤为显著，见图2B。

图2 照射对SMMC-7721细胞自噬的影响

2.3 激活和抑制自噬对肝癌SMMC-7721 细胞DNA放射损伤的影响 免疫荧光结果显示，不同时间点（0 h、4 h、24 h）细胞γ-H2AX的荧光焦点数有明显差异，IR 组在4 h γ-H2AX 荧光焦点数最多，24 h荧光斑点数目逐渐下降，DNA损伤基本修复；IR+3-MA 组在4 h 和24 h 时γ-H2AX 荧光焦点数多于IR组和IR+Rapamycin 组（P＜0.05），IR+Rapamycin 组在4 h 和24 h 时γ-H2AX 荧光焦点数少于IR+3-MA组和IR组（P＜0.05），见图3。

图3 激活和抑制自噬对肝癌SMMC-7721细胞DNA放射损伤的影响

3 讨论

放射治疗是肿瘤重要治疗策略之一。放射治疗的靶点是DNA，可直接或间接诱导DNA损伤，达到杀伤肿瘤细胞的效果[7]。因此，探讨抑制DNA损伤修复的机制，增加放射敏感性显得尤为重要。

DNA 损伤包括碱基损伤、单链断裂、双链断裂等。DNA 损伤的程度决定了细胞最终的结局，当DNA 损伤较轻时，可触发细胞内DNA 损伤修复机制，细胞得以存活[8]。但当DNA 损伤严重时，细胞将走向凋亡和坏死的结局[9]。γ-H2AX是DNA损伤的关键成分，γ-H2AX 焦点的形成可作为DNA 损伤的重要指标[10]。本研究发现，照射后SMMC-7721细胞DNA 发生严重的断裂，随着照射剂量的增加γ-H2AX蛋白表达增加，DNA损伤程度加重。

自噬是真核生物细胞内一种蛋白降解过程。研究表明，在饥饿、低氧、感染和DNA损伤等应激条件下自噬被诱导激活，以减少细胞损伤维持内环境稳态[6]。自噬失调时会导致过早衰老、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症等人类相关性疾病[11-12]。自噬在肿瘤发生、发展中起双重作用，但在大多数情况下自噬促进了肿瘤的发生[13]。越来越多的研究发现，在肿瘤细胞中自噬表达水平增加。因此，自噬逐渐成为肿瘤治疗一个潜在的靶点。在本研究发现SMMC-7721细胞照射后与NC组相比，IR组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达增加，在48 h 时LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化增多，自噬水平增加。结果表明，照射可诱导SMMC-7721 细胞自噬激活，48 h 时自噬激活相对增多。

自噬和DNA 修复是维持细胞正常状态的生物学过程，自噬可参与DNA损伤修复，然而DNA损伤修复与自噬之间的关系仍不清楚[14]。有研究表明，雷帕霉素激活自噬通过Stat3 信号通路降低骨髓血细胞DNA 放射损伤[15]。在Hela 细胞中自噬缺陷诱导p62 积聚导致了组蛋白泛素化的抑制，并抑制DNA 修复，增加体内和体外细胞对放射的敏感性[16]。AKT 抑制剂在恶性胶质瘤中诱导自噬具有放射增敏作用[17]。本研究通过激活和抑制自噬观察DNA 损伤的情况，发现照射后SMMC-7721 细胞γ-H2AX蛋白在4 h表达最高，说明DNA损伤最严重，24 h DNA 损伤降至基础水平；雷帕霉素激活自噬，γ-H2AX 蛋白在同一时间点较其他组表达低，说明DNA损伤修复时间缩短，促进了DNA损伤修复；当3-MA抑制自噬时，与对照组相比γ-H2AX蛋白表达增加，说明DNA 修复时间延长，细胞DNA 损伤加重，与以往的研究[18-19]相一致。结果表明，自噬对DNA损伤起保护性作用，抑制自噬可增加放射敏感性。

综上所述，照射可诱导肝癌SMMC-7721 细胞发生DNA 断裂损伤，同时激活自噬；自噬可促进放射线所致的DNA 损伤的修复。但本研究仅在体外进行验证，自噬与DNA损伤修复之间的关系还需大量的实验来证明。