丹酚酸A对心肌梗死大鼠心肌纤维化及心功能的作用及其机制*

石春光，黄 琛，胡益森，苏天柱，徐 戈△

（1.广西南宁市武鸣区中医医院心血管内科，武鸣 530199；2.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530001；3.广西医科大学第一附属医院心血管内科，南宁 530023）

急性心肌梗死是世界上导致患者死亡常见的心血管疾病之一[1]。心肌梗死后常发生心肌重构，是心力衰竭发生和发展的一种病理生理机制[2]。心肌间质纤维化是心肌重构的重要的组成部分[3-4]。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）能够调节细胞内Smad 家族转录因子，进一步调控纤维化相关基因表达，最终在心肌间质纤维化中发挥重要的调控作用[5-6]。Smad2 作为Smad 家族转录因子的重要成员之一，是TGF-β信号通路上关键的调控因子[7-8]。研究表明，TGF-β1/Smad2信号通路在心肌梗死大鼠心室重构和心肌纤维化方面发挥重要的调控作用[9-10]。丹酚酸A（salvianolic acid A,SAA）是一种从中药丹参中提取的有效化合物，具有抗氧化应激、抗细胞凋亡和抗炎症反应的作用[11-13]。近年来研究表明，丹酚酸A 能够减轻四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化[14]。然而，丹酚酸A 对心肌梗死大鼠的作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探讨丹酚酸A 对心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级成年雄性SD 大鼠，体重（280±10）g，购于广西医科大学实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK 桂2020-0003，使用许可证号：SCXK 桂2020-0004。所有动物在室温25 ℃、相对湿度50%、12 h/12 h昼夜明暗交替的环境中饲养，自由进食和饮水。

1.2 药物和主要试剂 丹酚酸A 购于北京索莱宝生物科技有限公司。Masson 试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；肌钙蛋白T 检测试剂盒、NT-proBNP 检测试剂盒购于武汉优尔生科技股份公司；CK-MB检测试剂盒购于南京建成公司。一抗TGF-β1、磷酸化（p-）Smad2、Smad2、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ抗体均购自Abcam 公司；红外标记荧光二抗购自CST公司。

1.3 实验分组与造模 将24只大鼠随机分为假手术组、模型组和丹酚酸A组，每组8只。所有大鼠用戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉后固定在手术台上，连接心电图，进行气管插管，在左胸壁第3与第4肋间剃毛，铺巾，碘伏消毒，开胸，破心包，在肺动脉圆锥与左心耳之间下2 mm 处穿线，模型组和丹酚酸A 组结扎冠状动脉左前降支，结扎后心肌呈灰白色，心电图Ⅱ导联抬高（振幅>0.2 mV）为心肌梗死造模成功标志。假手术组大鼠仅穿线不结扎。3组大鼠手术后逐层关胸，消毒手术切口，待大鼠苏醒，继续正常饲养。造模后，丹酚酸A组腹腔注射10 mg/kg丹酚酸A（溶于生理盐水）[15-16]，1次/d，连续4周。假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水。

1.4 大鼠心功能检测 给药结束后，戊巴比妥麻醉大鼠，固定在动物手术台上，行右侧颈动脉插管，待左室压力曲线稳定后，通过MPA心功能分析仪检测大鼠左心室舒张末期压力（LVEDP）、左心室收缩压力（LVSP）、左心室压力上升的最大变化率（+dp/dtmax）和左心室压力下降的最大变化率（-dp/dtmax）。监测3个心动周期，计算各指标的平均值。

1.5 样本收集 大鼠心功能检测完毕后，经腹主动脉取血，4 000 r/min 离心20 min，取上清，分装保存至-80 ℃冰箱。处死大鼠，剪取大鼠心脏，取心肌梗死边缘区，用预冷的生理盐水冲洗，快速剪取一部分心肌组织保存于-80 ℃冰箱中，另一部分心肌组织置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清肌钙蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平 取各组大鼠血清，采用ELISA 法检测大鼠血清中肌钙蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平。检测过程严格按照试剂盒说明说操作。

1.7 Masson 染色检测心肌纤维化 取各组心肌组织，梯度乙醇脱水，充分浸泡于二甲苯，石蜡包埋，常规切片，行Masson 染色，显微镜观察心肌组织纤维化情况。使用Image J软件分析纤维化面积，计算蓝色区域的面积（纤维化区域）与红色区域的面积（正常心肌）的比值，即胶原容积分数。

1.8 免疫组织化学染色法检测心肌组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ纤维化相关蛋白表达 取心肌组织切片，脱蜡，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，3%BSA 室温封闭30 min，一抗4 °C 孵育过夜，二抗孵育1 h，DAB显色，复染细胞核，脱水，中性树胶封片。显微镜下随机选取5个不连续视野，观察染色结果，棕黄色颗粒即为阳性细胞。用Image J 软件测量每张图片的累积光密度（IOD）以及区域面积，计算平均光密度（AOD），AOD=IOD/面积。

1.9 Western blotting 法检测心肌组织TGF-β1、Smad2 和p-Smad2 蛋白表达 取心肌组织，加入适量RIPA裂解液，充分研磨，低温离心，取上清，BCA法检测蛋白浓度，加热使蛋白变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗Smad2（1∶1 000），p-Smad2（1∶1 000），β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育过液，洗膜3次；荧光二抗（1∶14 000）室温孵育2 h，用Odyssey 双色红外极光成像仪（LICOR 公司）扫膜。用Image J 软件分析TGF-β1和p-Smad2蛋白表达水平。

1.10 统计学方法 所有数据使用SPSS 18.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹酚酸A 改善心肌梗死大鼠的心功能 与假手术组比较，模型组大鼠LVEDP 明显升高，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显降低（均P＜0.05）；与模型组比较，丹酚酸A 组大鼠LVEDP 明显降低，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显升高（均P＜0.05），见表1。

表1 3组大鼠心功能比较，n=8

表1 3组大鼠心功能比较，n=8

与假手术组比较，aP＜0.05；模型组比较，bP＜0.05。

2.2 丹酚酸A 降低心肌梗死大鼠血清心肌肌钙蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平 与假手术组比较，模型组血清中肌钙蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹酚酸A组血清中肌钙蛋白T、CK-MB和NT-proBNP水平明显降低（P＜0.05），见图1。

图1 3组大鼠血清肌钙蛋白T、CK-MB和NT-proBNP水平比较

2.3 丹酚酸A 降低心肌梗死大鼠心肌胶原容积分数 与假手术组比较，模型组CVF 明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹酚酸A 组CVF 明显降低（P＜0.05），见图2。

图2 3组大鼠心肌胶原容积分数比较

2.4 丹酚酸A 减少心肌梗死大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达 与假手术组比较，模型组大鼠心肌Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹酚酸A 组大鼠心肌Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达明显降低（P＜0.05），见图3。

图3 3组大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达比较

2.5 丹酚酸A 减少心肌梗死大鼠TGF-β1 和p-Smad2 蛋白表达 与假手术组比较，模型组大鼠TGF-β1 和p-Smad2 蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹酚酸A组大鼠TGF-β1和p-Smad2蛋白表达明显降低（P＜0.05），见图4。

图4 3组大鼠TGF-β1和p-Smad2蛋白表达比较

3 讨论

急性心肌梗死是导致患者死亡的重要心血管疾病之一，其发生后常伴随心肌重构；心肌间质胶原沉积是心肌重构的重要特征[17]。大多数心肌胶原纤维是由Col-Ⅰ、Col-Ⅲ组成，其中Col-Ⅰ占健康心脏中约80%的胶原蛋白[18]。在正常生理状态下，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等胶原蛋白的合成和分解处于动态平衡中；然而在某些病理条件下，如心肌梗死发生后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等胶原蛋白的合成多于分解导致过多的胶原蛋白沉积在心肌间质，进而发展成心肌纤维化[19-20]。Qiang 等[21]研究发现，丹酚酸A 能够预防高脂饮食喂养和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肝纤维化的病理进展。Zhu等[22]研究发现，丹酚酸A通过SIRT1/HSF1 信号通路减轻内质网应激并防止胆汁淤积诱导的肝纤维化。Pan 等[23]研究发现，丹酚酸A 通过抑制成纤维细胞增殖和促进细胞凋亡来缓解肺纤维化。Chen等[24]研究发现，丹酚酸A能够改善野百合诱导的肺动脉高压大鼠的肺动脉重构。本研究结果显示，模型组血清中肌钙蛋白T 和CK-MB水平明显升高，而丹酚酸A组血清中肌钙蛋白T和CK-MB水平较模型组显著降低。此外，模型组心肌胶原容积分数、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达升高，丹酚酸A组心肌胶原容积分数、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达较模型组显著降低，说明丹酚酸A能够减轻心肌梗死大鼠心肌损伤和心肌纤维化。另有研究表明，过度的心肌纤维化能够导致心功能异常[25-27]。因此，本研究检测大鼠心功能和血清中NTproBNP 水平，结果发现，模型组大鼠较假手术组大鼠LVEDP 和血清中NT-proBNP 水平明显升高，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显降低；丹酚酸A 组大鼠LVEDP 和血清中NT-proBNP 水平明显降低，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显升高，这些结果表明丹酚酸A能有效改善心肌梗死大鼠的心功能。

心肌梗死时TGF-β1 被激活，继而与TGF-β 受体结合，使得下游转录因子Smad 活化，进而促进Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等纤维化基因的表达，导致过度的胶原沉积在心肌间质，最终出现心肌纤维化[28-29]。Dai等[30]研究发现，丹酚酸A 能够下调TGF-β1 表达，抑制Smad2激活，进一步减轻槟榔提取物诱导的口腔黏膜下纤维化。为进一步研究丹酚酸A 抑制心肌梗死大鼠心肌重构的潜在机制，本组检测了TGFβ1/Smad 信号通路的相关蛋白。结果显示，模型组TGF-β1和p-Smad2蛋白表达明显升高，与模型组比较，丹酚酸A 组TGF-β1 和p-Smad2 蛋白明显降低，说明丹酚酸A能够抑制TGF-β1/Smad2信号通路。

综上所述，丹酚酸A 能够改善心肌梗死大鼠心肌纤维化，进而改善心功能，该作用可能与抑制TGF-β1/Smad2信号通路有关。