积分球测量荧光量子产率的最优测试条件研究

胡晓月，屈泽华，黄红香

(复旦大学高分子科学系 聚合物分子工程国家重点实验室，上海 200438)

0 引 言

荧光量子产率，是单位时间（s）内，发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数之间的比值，符号φf。它表示物质将吸收的光能转变成荧光的能力，是荧光物质一个最基本而重要的参数[1]。φf值的大小与物质的化学结构紧密相关，任何影响物质化学结构的因素都会导致荧光量子产率的改变。因此，荧光量子产率的测量可以为分子结构及其变化情况的研究提供一定的帮助。

测量荧光量子产率的方法主要有两种：一种是参比法，测得的是相对荧光量子产率；另一种是直接法，测得的是绝对荧光量子产率。参比法测量荧光量子产率的优点是：操作简便，可以消除标准样品与待测样品共同的误差来源，从而提高测量准确度[2-4]。但是，参比法也有很大的局限性：待测样品的光谱位置与标准样品的光谱位置必须相接近，且必须为液体。这就导致大量的无合适标准样品匹配的液体样品以及固体样品的荧光量子产率无法测量。直接法在20世纪60年代以前是测量荧光量子产率的主要方法，但是该方法限于当时测量工作繁琐，且误差来源较多，一度被参比法取代[5]。随着科学技术水平的不断进步，采用直接法测量荧光量子产率的测量工作已大大简化，并具有较好的测量准确度。而且，采用直接法测量荧光量子产率不受标准样品匹配和样品状态的限制，可以应用于绝大部分样品的荧光量子产率测试，很好地弥补了参比法的不足之处，目前得到越来越广泛的关注和应用[6-8]。

采用积分球测量荧光量子产率的方法属于直接法，该方法已广泛应用于荧光量子产率的测试[9]。但是，对于该方法的各种影响因素的研究却少有报道[10-11]。而不同测试条件的选择，势必会对测试的准确度产生影响。为确保能够快速、准确地得到荧光量子产率的数据，针对积分球测量荧光量子产率的最优测试条件研究是十分重要的。因此，本文针对采用积分球测试荧光量子产率时的测试条件选择进行了研究，为绝对荧光量子产率的测试工作提供了一定的参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：PTI稳态/瞬态荧光光谱仪 QM40 及 60 mm积分球附件。

标准品：罗丹明 6G，纯度 99%，CAS:989-38-8，百灵威公司；硫酸奎宁，纯度 99%，CAS:6119-70-6，百灵威公司。

试剂：乙醇，分析纯，国药集团有限公司；稀硫酸，分析纯，国药集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

1) 罗丹明6G溶液：准确称取罗丹明6G标准品 4.43 mg，用乙醇溶解后定容，配制成浓度为10–3mol/L 的溶液备用。然后将其稀释为 10–5mol/L的溶液备用。

2) 硫酸奎宁溶液：准确称取硫酸奎宁标准品39.1 mg，用 0.1 mol/L 硫酸溶解后定容，配制成浓度为 5×10–3mol/L 的溶液备用。

1.2.2 荧光量子产率测试条件

1)罗丹明6G测试条件

改变步长和积分时间实验条件：浓度10–5mol/L，激发光波长488 nm，扫描范围 400～700 nm，激发端狭缝 5 nm，发射端狭缝 0.7 nm。

改变狭缝实验条件：浓度 10–5mol/L，激发光波长 488 nm，扫描范围 450～720 nm，激发端狭缝 6 nm，步长 1 nm，积分时间 0.1 s。

改变激发波长实验条件：浓度 10–5mol/L，激发端狭缝 6 nm，发射端狭缝 1 nm，步长 1 nm，积分时间 0.1 s。

2)硫酸奎宁测试条件

改变步长和积分时间实验条件：激发光波长390 nm，扫描范围 350～700 nm，激发端狭缝 6.4 nm，发射端狭缝1 nm。

改变狭缝实验条件：激发光波长390 nm，扫描范围 350～700 nm，激发端狭缝 6.4 nm，步长 1 nm，积分时间 0.5 s。

改变激发波长实验条件：激发端狭缝6.4 nm，发射端狭缝 1 nm，步长 1 nm，积分时间 0.5 s。

2 结果与讨论

2.1 标准品的选择

研究各种测试条件的改变对测试结果的影响，首先选择标准物，标准物的选定原则为：具有稳定的荧光性质，以及被广泛采纳的荧光量子产率。本文选择了罗丹明6G和硫酸奎宁两种物质作为标准样品。这两种化合物均是较为经典的荧光物质，具有十分稳定的荧光性质，以及被广泛接受的荧光量子产率，并且经常被选为参比法测试荧光量子产率的标准物[12]。本文选用了两种化合物较为常用的荧光量子产率数值，即罗丹明6G在乙醇溶液中的量子产率值为0.891，硫酸奎宁在0.1 mol/L稀硫酸溶液中的量子产率值为0.51[13]。

2.2 仪器参数选择

在采用积分球测试荧光量子产率的过程中，影响测试结果准确率的最直接因素来源于仪器本身，即测试参数（步长、积分时间和狭缝）的选择。首先测试了不同参数条件下标准样品的荧光量子产率，并对结果进行分析，以期得到最佳的测试参数。

2.2.1 步长和积分时间选择

步长是指测试曲线上两点之间的距离，单位：nm。积分时间是指测试曲线上每一点的收集时长，单位：s。步长和积分时间是测试中最基本的两个测试参数。本文分别测试了标准样品罗丹明6G和硫酸奎宁在不同步长和积分时间条件下的荧光量子产率，得到结果如表1和表2所示。

表1 罗丹明6G在不同积分时间和步长下的荧光量子产率

表2 硫酸奎宁在不同积分时间和步长下的荧光量子产率

从表1和表2可以看出，随着步长和积分时间的逐渐改变，标准样品（罗丹明6G和硫酸奎宁）荧光量子产率的数值并没有出现规律性的变化，而是呈现跳跃的状态。与文献报道的标准样品荧光量子产率相比较，对数据进行误差分析并作图，如图1和图2所示。从图中看出：测试得到的荧光量子产率的准确率与步长和积分时间的改变并没有线性关系。但是，这也并不意味着可以随意设置步长和积分时间。因为步长和积分时间的改变会影响测试曲线的光滑度，从而对最终测试结果产生一定的影响。因此，在测试中应尽可能的保证曲线完整光滑。在此基础上，可以选择较短的积分时间和较长的步长来缩短总的测试时间。

图1 罗丹明6G量子产率测试误差示意图

图2 硫酸奎宁量子产率测试误差示意图

另外，通过误差分析发现，采用积分球测试荧光量子产率的误差在5%左右。即使是同一样品，在同样条件下，连续几次测试的结果也会有5%以内的误差。因此，要提高测试的准确率，采取多次测量取平均的方式更为有效。

2.2.2 狭缝选择

狭缝是控制光通量的部件，狭缝的改变会引起荧光强度的改变。测试中，在保证一定荧光强度的基础上，通常会选择尽可能小的狭缝，以减小误差。

本文测试了标准样品（罗丹明6G和硫酸奎宁）在不同荧光强度时的荧光量子产率，结果如图3和图4所示。对于高量子产率的罗丹明6G，强度的改变对测试结果准确率影响较大；而对于量子产率中等强度的硫酸奎宁，强度的改变对测试结果准确率的影响并不明显。因此，在测试具有较高荧光量子产率的荧光物质时，需要控制其荧光强度，不宜太高。

图3 罗丹明6G在不同荧光强度下的量子产率

图4 硫酸奎宁在不同荧光强度下的量子产率

2.3 激发波长的影响

每种荧光物质都有其最佳的激发位置，测试荧光量子产率时，一般选择其最佳的激发位置激发。但是，在荧光量子产率测试中经常会遇到激发峰与发射峰有交叠的情况，这种情况给荧光量子产率的计算带来了一定的困难，对最终的结果有一定影响。这种情况可以通过移动激发波长位置从而避免交叠而改善。但是，改变激发波长位置会影响荧光量子产率，为研究这种影响有多大，本文测试了标准样品（罗丹明6G和硫酸奎宁）在不同激发波长激发下的荧光量子产率，结果如图5和图6所示。

图5 罗丹明6G在不同激发波长下的荧光量子产率

图6 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光量子产率

从图中可以看出：激发波长的改变对荧光量子产率影响较大，即使间隔10 nm激发也会产生较大差别。因此采用积分球测试荧光量子产率时，最好不要移动激发波长位置，以确保测试结果的准确。

3 结束语

本文采用积分球测试了标准样品罗丹明6G和硫酸奎宁在不同仪器参数（步长、积分时间和狭缝）下，以及不同激发波长下的荧光量子产率。通过与文献报道的荧光量子产率对比分析，得出使用积分球测量荧光量子产率的最佳测试条件：在保证测试曲线光滑且荧光强度合适的情况下，尽可能选择较长的步长、较短的积分时间以及较小的狭缝，并且在测试中保持激发波长的位置不变。采用积分球测量荧光量子产率，选用本文得出的测试条件，测试结果更可靠、准确。