国家重点研发计划“食品风险组分毒理学通路鉴别确证技术研究(2017YFC1601702)”进展

针对用传统的毒理学方法进行毒性物质职业健康安全性风险评估存在耗时费力和食品风险组分毒性预测困难的问题，本研究开展食品风险组分毒理学通路鉴别确证技术方面的研究。

1 研究目的

使用遗传通路对新型潜在食品风险化合物的遗传毒性进行筛选和确证，为食品非法添加物对职业健康的危害预防提供信息和技术支撑。

2 研究方法

(1)构效关系分析初筛。研究针对2010年国家卫健委公布的食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品非法添加物品种名单(共6批)，共126种食品添加物。本次研究使用的工具为Toxtree(version2.6.13)，通过输入各种受试物的原型编码或化学结构，以决策树的形式，根据结构警示对物质的遗传毒性进行分类和预测。

(2)脱细胞彗星实验模型。该模型的制备过程如下：

制片：从SD大鼠眼眶取约1.5ml静脉血，制备脱细胞核DNA板。

染毒与漂洗：以细胞裂解液作为染毒缓冲液。按受试物溶液分为高、中、低3个剂量组，以高剂量组为基准，以2倍倍比关系稀释为中、低剂量组，将纯水和相同细胞裂解液作为对照组。

解旋与电泳：在碱性电泳液避光解旋30min。调节电压25V，电流300mA，在碱性电泳液电泳，室温30min。

漂洗：用纯水漂洗，清洗中和电泳液，洗去过多的盐(2次，5min/次)。

染色：滴加Gelred荧光染料染色，彗星光学显微镜下观察损伤，然后用专业软件(CometA1.0)定量分析尾部DNA百分比。该模型与单纯脱细胞彗星试验相比，采样简便，省时省力。

(3)细胞彗星实验。选用繁殖能力强的悬浮细胞YAC-1小鼠淋巴瘤细胞。具体的实验过程如下：

染毒：将离心后的细胞加入受试物，阴性对照组(二甲基亚砜终浓度<0.05%)，六孔板染毒，每个剂量、每个受试物3个平行对照，共同放入37℃、5%CO的细胞培养箱3h。

涂片：弃上清，收集细胞沉淀与70μl上样胶涂在彗星载玻片上，作为一个样本。

裂解：将载玻片浸没于细胞裂解液，4℃下避光裂解1.5h(裂解液提前30min放入4℃冰箱，去除细胞膜与核膜，做成细胞核DNA板)。

漂洗：从裂解液中取出载玻片，在纯水中洗去过多的盐(2次，5min/次)。

解旋与电泳：在碱性电泳液避光解旋30min。调节电压25V，电流300mA，在碱性电泳液电泳，室温30min。

漂洗：用纯水清洗中和电泳液，在纯水中洗去过多的盐(2次，5min/次)。

染色：滴加Gelred荧光染料，彗星光学显微镜下观察损伤，用专业软件(CometA1.0)定量分析尾部DNA百分比。

(4)哺乳动物体内彗星联合微核实验。本实验的动物染毒、取材及过程如下：购买的动物在实验前适应环境3天，适应期进行检疫和观察，期间自由饮水和摄食。受试物用水或食用油作为媒介，溶解或悬浮于媒介中，受试物以灌胃方式给与，大鼠灌胃体积不超过10ml/kg体重，实验动物随机分组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组为水或食用油，阳性对照组为40mg/kg bw环磷酰胺(CP)，食品非法添加物LD的1/4作为高剂量，中、低剂量组按2倍倍比关系稀释。2次给受试物间隔24h，第2次给受试物6h后，对动物腹腔注射麻醉，采外周血、分离肝细胞、分离骨髓细胞开展碱性和中性彗星实验，同时骨髓细胞开展微核试验。

3 研究成果

(1)确立DNA损伤筛选模型：脱细胞彗星实验筛选模型、细胞彗星实验筛选模型、哺乳动物体内彗星联合微核实验确证模型。

(2)食品非法添加物中遗传毒性物质的筛选：完成126种非法食品添加物的筛选，筛选出11种可疑遗传毒性物质(乙醇、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、三聚氰胺、黄原胶、诱惑红、酸性橙(橙黄Ⅱ)、碱性橙、甲醛次硫酸氢钠二水合物)。

(3)靶器官遗传毒性联合确证：采用哺乳动物体内碱性彗星、中性彗星及微核实验对以上11种可疑遗传毒性物质短期染毒未发现遗传毒性；乙醇在一定剂量范围内致骨髓细胞DNA单链断裂的剂量—反应曲线呈现倒置的“U”字形。骨髓可作为乙醇的靶器官并可产生遗传毒性。

4 经济社会效益

(1)对学科/行业产生重要影响。建立的DNA损伤快速筛选，可以实现遗传物质的快速筛选和确证，完善了遗传毒理学的方法体系，为职业健康提供重要支持。利用本模型通过初步筛选已经发现的126种非法食品添加物中可能具有遗传毒性的种物质。为后续开展针对这些物质的职业健康安全性风险评估奠定基础，同时有助于提高食品安全水平。

(2)对社会民生、生态环境、国家安全等产生积极作用。本课题建立的DNA损伤筛选和确证体系具有灵敏度高、实验周期短、检测成本低、对实验室硬件要求低的特点。从遗传毒性通路为食品非法添加物的监管、检测和危害预防提供技术支撑，有助于避免食品安全事件的发生，保障国民生命健康，减轻职业人群的经济负担和健康安全风险。

(3)人才、专利、技术标准战略在项目实施中取得初步成果。项目团队重视人才培养,积极实施专利技术标准战略。本年度多名博士生、硕士生正在培养中，丰硕的人才培养成果为推动食品真实性鉴别领域技术发展提供人才支撑。已培养和在培养学生3名；发表论文2篇；获食品安全国家标准立项1项。