肿瘤相关成纤维细胞来源外泌体miRNA对结直肠癌发展的促进作用研究进展△

陈超，孙建飞，魏海梁，冯冠强

1陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 712000

2陕西中医药大学附属医院普外科，陕西 咸阳 712000

目前，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是第二大可导致肿瘤相关性死亡的疾病，其易转移及不良预后的特点，不断地为临床工作带来挑战。基质细胞在肿瘤进展和治疗反应中具有重要意义。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）是肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中最活跃的组成部分，可通过分泌各种趋化因子和细胞因子与肿瘤细胞相互作用促进肿瘤血管生成、细胞增殖、迁移和转移。同时，许多 miRNA（miRNA-1246、miRNA-21、miRNA-329、miRNA-181a、miRNA-199a、miRNA-92a-3p、miRNA-17-5p和miRNA-24-3p等）组成的新型外泌体信号增强了CAF与肿瘤间的信息交流。外泌体miRNA通过靶向抑制目的基因在结直肠癌的增殖、迁移、侵袭、转移、干性、细胞耐药中发挥重要作用。因此对于CAF来源外泌体miRNA在此过程中扮演的角色越来越受到人们的关注。本文就CAF外泌体miRNA在TME中对CRC的影响作一综述，以期为深入探究CAF在CRC中的作用提供新的线索。

1 CAF与CRC

1.1 CAF

成纤维细胞是结缔组织最常见的成分，是肿瘤中CAF的主要来源之一。一般状况下，它们处于静止期，在有丝分裂中是无活性的，直到它们响应组织损伤或对不同类型的压力时，成纤维细胞的表型转化为激活状态。肿瘤可以比喻为“无法愈合的伤口”，肿瘤基质细胞的重建过程与伤口愈合有一些共同的相似之处。在肿瘤发生过程中，常驻成纤维细胞被肿瘤细胞和免疫细胞的信号激活，由此被称为CAF。这些信号分子包括CAF激活剂转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）配体（如血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子和表皮生长因子）以及促炎分子[如白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6]，它们通过核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活驻留的成纤维细胞。另外，环境应激[如反应性氧物质、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）刚度等]和化疗或放疗引起的DNA损伤可通过JAK-信号转导与转录激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）途径激活CAF。而活化的CAF常特异性表达平滑肌肌动蛋白（a smooth muscle actin，a-SMA）、成纤维细胞活化蛋白-α（fibroblast activation protein-α，FAP-α）、成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1）或血小板源性生长因子受体-β（platelet-derived growth facter receptor-β，PDGFR-β）等标志分子。

1.2 CAF与CRC

研究发现CAF活化是ECM蛋白质合成和分泌的一个关键事件，导致ECM重塑和增加肿瘤细胞的侵入性。CAF和肿瘤细胞之间是通过复杂的信号网络介导的，每种细胞类型通过协同或拮抗的信号转导轴相互影响。大量体外和体内研究已揭示CAF可通过生长因子、趋化因子、基质细胞衍生因子1等肿瘤相关因子的释放和ECM重塑影响CRC的进展。此外尽管miRNA表达及功能对CAF和肿瘤细胞之间相互作用的影响尚未完全阐明，但有关证据表明，源自CAF的外泌体中的miRNA失调通过多种机制影响肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移和治疗抵抗，最终调节肿瘤的进程。

2 外泌体miRNA

外泌体是脂质双层形成的40～100 nm的细胞外囊泡，参与各种生理和病理过程。它们可以在细胞之间穿梭以促进细胞间的通讯，在肿瘤增殖、侵袭、转移等方面发挥关键作用，并且可通过修饰受体肿瘤细胞中的基因表达来增强化学抗性和放射抗性。研究已经表明，外泌体能够承载多种类型的分子以促进细胞间通讯，如miRNA、mRNA、长链非编码RNA、DNA、蛋白质和脂质。

miRNA是由外泌体递送的重要货物。miRNA通常由19～25个小型单链非编码RNA组成，可以调节靶基因的转录后沉默。miRNA基因转录后，会产生一个称为pre-miRNA的小发夹状RNA。pre-miRNA被输出到细胞质后被RNA酶Ⅲ型内切核酸酶处理，随后释放小RNA双链体。加载到AGO蛋白上并形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）后，RNA双链体将解开。一旦与RISC结合，miRNA将与mRNA互补配对。根据miRNA和mRNA是否完全结合，会发生两种不同的机制：①如果miRNA与mRNA足够互补，则mRNA会裂解。②当miRNA与mRNA有不充分互补则翻译被抑制。因此，miRNA可以调节各种生理和病理活动。

3 外泌体miRNA与CRC发展的关系

CRC是一种异质性疾病，各种信号通路在其进展中起着关键作用。TME中的外泌体miRNA被认为是恶性转化的诱因。外泌体miRNA作为介导肿瘤进展和抑制的细胞间信号分子，可以针对肿瘤进展中涉及的通路成分，最显著的是

APC

、

KRAS

和

p53

，它们可以作为CRC中的致癌基因或抑癌基因。已有证据表明，CAF外泌体含有的miRNA可以影响肿瘤细胞增殖、血管生成、转移、凋亡、细胞周期调节和转移。因此，放松miRNA管制会影响肿瘤的生长。

3.1 外泌体miRNA促进CRC增殖及相关血管生成

肿瘤细胞的增殖是肿瘤进展中最重要和最基本的步骤。除了如前所述的各种细胞因子或趋化因子，外泌体miRNA生长抑制相关的细胞周期蛋白在肿瘤细胞增殖的调控中发挥重要角色。

CCNG2

是负责编码与生长抑制相关的细胞周期蛋白G2（cyclin G2，CycG2）的基因，CycG2的下调可导致多种肿瘤的生长增强。因此，CCNG2的下调可导致肿瘤细胞在G/G期的比例降低。而CAF外泌体miRNA-1246可靶向抑制CCNG2表达来介导CRC的恶性进展。并且CAF外泌体通过TGF-β信号通路促进CRC进展。例如，CAF外泌体miRNA-17-5p直接靶向RUNX家族转录因子3（RUNX family transcription factor 3，RUNX3）。RUNX3与原癌基因

MYC

相互作用并与TGF-β1的启动子结合，从而激活了TGF-β信号通路。RUNX3/MYC/TGF-β1通路刺激 TGF-β1释放活化的CAF分泌更多的miRNA-17-5p，从而导致CAF大量激活，促进CRC增殖、化学抗性和转移。

同样，血管生成是满足实体瘤生长所需营养的关键过程。血管生成对应于主要血管网络的萌芽、重塑和扩张，由原有血管形成新血管。肿瘤细胞会在周围环境中产生并分泌因子，从而促进新血管的生长，该过程受到包括血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和TGF-β在内的几种生长因子的严格调控。在这些生长因子中，TGF-β是一种多功能的细胞因子，可以调节内皮细胞（endothelial cell，EC）（血管的主要成分）的两种不同的Ⅰ型受体，即激活素受体样激酶（activin receptor-like kinase，ALK）1和ALK5之间的信号转导体内平衡。ALK1是内皮细胞限制性TGF-βⅠ型受体，可诱导SMAD1/5/8磷酸化增强血管生成。而ALK5可以促进SMAD2/3的磷酸化，并抑制EC的增殖、迁移和血管形成。SMAD1/5/8信号和SMAD2/3信号之间的激活比例最终决定了EC是否开始增殖或保持静止。miRNA-1246直接靶向PML（ALK1-SMAD2/3信号的调节剂），从而抑制SMAD2/3信号，这种信号的失活导致SMAD1/5/8信号的相对激活，从而促进血管生成。

3.2 外泌体miRNA促进CRC迁移、侵袭和转移

在大多数CRC患者中肿瘤细胞向远处器官的扩散，往往预示着不良的生存期。miRNA-21具有对若干肿瘤类型的致癌效应已被广泛接受，其最充分的描述是与肿瘤抑制因子磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性死亡受体4（programmed cell death 4，PDCD4）的相互作用。实验证明外泌体miRNA-21可直接与PDCD4的3'-UTR结合，抑制PDCD4活性，从而导致侵袭能力增强。CAF以多种方式对肿瘤的侵袭、迁移和转移发挥作用。CAF中的miRNA失调也可以通过调节ECM重塑来介导肿瘤细胞的侵袭和转移。在鉴定CRC中亚组特异性miRNA和功能基因集的联合回归模型中发现，某些miRNA可以调节ECM靶基因。实验证明，外泌体中miRNA-19、miRNA-17和miRNA-200c的高表达可以在蛋白质水平调节ECM靶基因的表达，调节ECM重塑从而增强肿瘤细胞的侵袭力。相关研究表明，纤溶酶原激活剂抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）作为一种分泌蛋白，是CAF与上皮肿瘤细胞间串扰的重要中介物，可触发上皮样肿瘤细胞的生长和极性变化。而miRNA-200b、c/NF-κB轴可借由增加PAI-1的表达，诱导肿瘤细胞发生极性消失，例如E-钙黏蛋白减少和波形蛋白增加，从而增强其侵袭性。通过共培养或异种移植实验所证实，CAF中的其他miRNA也参与体外或体内肿瘤的侵袭、迁移和转移。

3.3 外泌体miRNA激活CRC干性

在肿瘤的发生、发展和治疗抵抗中部分细胞群具有巨大的自我更新和分化潜力，这些细胞被定义为肿瘤干细胞，其干性的获得和维持受到许多因素影响。CAF促进干性的能力已被广泛研究，但CAF衍生miRNA在干性调控中作用的研究相对较少。FBXW7和MOAP1分别是重要的促凋亡肿瘤抑制分子，MOAP1与最主要的凋亡基因

BAX

结合可诱导细胞凋亡。研究发现FBXW7和MOAP1的过表达可促进β-catenin的泛素化降解来抑制WNT/β-catenin途径并促使线粒体凋亡，最终抑制细胞干性和促进细胞凋亡。CAF外泌体miRNA-92a-3p通过靶向抑制FBXW7和MOAP1促进肿瘤细胞干性和EMT并抑制细胞凋亡，同时可增强对5-氟尿嘧啶/奥沙利铂的抗性。总体而言，miRNA代表CAF调节干性的重要方式，值得进行更深入和广泛的探索。

3.4 外泌体miRNA促进CRC耐药

研究证明，CAF与治疗耐药性和不良预后密切相关。CAF可通过多种机制来增强肿瘤的治疗抗性，包括分泌旁分泌信号转导介质（如细胞因子和外泌体）、预防药物输送、重新编程新陈代谢和信号通路的调节。miRNA在这些过程中也起着不可替代的作用。在CAF外泌体对卵巢癌顺铂耐药的探索中发现CAF衍生的miRNA-98-5p与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）之间存在关联。剔除下游目标

CDKN1A

可以促进卵巢癌细胞的顺铂耐药性，增加卵巢癌细胞的增殖，并减少以前对顺铂敏感细胞的凋亡。这项研究帮助阐明了CAF通过miRNA-98-5p介导的CDKN1A抑制卵巢癌治疗耐药性的潜在机制。研究发现与过度表达miRNA-21的成纤维细胞共培养可以保护结直肠癌细胞免受奥沙利铂诱导的细胞凋亡，并增加这些细胞的增殖能力。并且在卵巢癌耐药的机制研究中发现，将CAF转移到肿瘤细胞的外泌体miRNA-21不仅促进细胞侵袭，而且通过与凋亡酶激活因子结合抑制细胞凋亡并诱导紫杉醇耐药。研究发现，尾端相关同源盒2（caudal type homeobox 2，CDX2）/肝素轴在结肠癌的甲氨蝶呤抗性中起作用，CDX2的过表达可以降低结肠癌细胞对甲氨蝶呤的抗性。在结肠癌进展过程中CAF外泌体miRNA-24-3p通过抑制CDX2对肝素表达的强化作用，提高了结肠癌细胞对甲氨蝶呤的抵抗力。研究表明，在胃癌的背景下，CAF分泌外泌体miRNA-522通过靶向花生四烯酸脂氧合酶15抑制肿瘤细胞的肥大化，阻断有毒脂质过氧化物的积累，从而防止了肥大化导致的非凋亡性细胞死亡。

3.5 外泌体miRNA促进CRC放疗抵抗

为了有效减少局部晚期或播散性CRC患者局部复发，非手术联合放射治疗越来越受到重视。但CRC细胞对放疗的抵抗力对于患者预后具有不良影响。CAF衍生的外来体的研究为临床工作者提供了新的候选目标。研究发现，辐照引起G/S期细胞周期过渡延迟和细胞凋亡促进。叉头框蛋白A1（fork head box A1，FOXA1）可以与目标基因的启动子结合，以影响肿瘤细胞周期。FOXA1的上调提高了G期细胞的比例，降低了S期细胞的比例，并提高了细胞凋亡率。辐照后，细胞中FOXA1更为显著过表达。FOXA1可以负调控TGF-β3的转录，并防止其转位入核抑制TGF-β信号通路、G/S期细胞周期过渡。在线分析网站Targetscan揭示了miRNA-93-5p和FOXA1之间存在特定的结合位点。携带外泌体miRNA-93-5p的CAF通过下调FOXA1促进CRC细胞的化学抗性。并且在SW620和HCT116细胞中引入miRNA-145会降低干细胞和放疗的抵抗力。研究证实，CAF外泌体miRNA-590-3p也在CRC发展中发挥作用。已经发现氯化物通道附件4（chloride intracellular channel 4，CLCA4）充当肿瘤抑制因子，能够通过抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/丝氨酸/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号转导途径来阻止膀胱癌细胞的恶性表型。并且在肝癌的研究中也已经发现CLCA4可通过抑制PI3K/AKT信号通路来预防疾病的发展。同时PI3K/AKT信号通路的激活与各种肿瘤的抗辐射能力密切相关，可见PI3K/AKT途径的激活导致对多种针对肿瘤的疗法产生抵抗力。通过数据库生物信息学分析发现，

CLCA4

可能作为miRNA-590-3p的靶基因被抑制，以此增强了CRC细胞对辐射的抵抗力。因此PI3K途径抑制剂化疗药物增敏剂也应用于临床。并且另一研究发现miRNA-590-3p还具有通过直接靶向免疫球蛋白样结构域蛋白1来促进人类胶质母细胞瘤细胞对放疗的抗性能力。

4 CAF中的miRNA作为肿瘤生物标志物

尽管近年来，CRC的检出率不断提高，然而其早期诊断率仅达到30%～40%，剩余的一大部分患者错失了最佳的根治性手术时机，导致其预后不良。所以，有效检测生物标志物无疑将大大有助于肿瘤患者的治疗和延长生存时间。因此，除了研究miRNA在CAF与肿瘤细胞之间的相互作用外，许多研究已经开始考虑CAF外泌体中miRNA作为预后生物标志物的潜能。在对照CRC患者和健康个体的血清外泌体miRNA表达水平中发现，与健康个体相比，CRC患者的miRNA-21、miRNA-92a-3p和miRNA-17-5p水平均明显更高，甚至可将CRC与健康个体准确区分开，且在手术后CRC患者miRNA的表达水平降低到健康个体水平。并且miRNA-92a-3p和miRNA-17-5p对健康个体与CRC患者进行分类中，曲线下面积分别为0.845和0.897。另外，在CRC的癌前病变-腺瘤阶段受试者血清中的外泌体miRNA-29a和miRNA-21的表达水平与健康个体有明显差异，同时发生肝转移与CRC原发性肿瘤患者组织血浆中外泌体miRNA-21表达水平上调，且总生存率较低。所以，miRNA作为诊断及评价患者预后标志物的潜力毋庸置疑。

5 小结

目前研究发现CAF在CRC的疾病进展中发挥重要作用。在CAF外泌体相关研究中发现miRNA能够通过肿瘤细胞间信号通讯促进肿瘤细胞增殖、上皮-间充质转化、侵袭、诱导血管生成和代谢重编程。但现有大多数研究都集中在由单个miRNA介导的单个信号转导途径的机制上。实际上一个miRNA能够抑制多个基因的表达，一个靶基因也受多个基因调控。上述研究缺乏对TME中复杂的调控网络的进一步研究，研究结论仅涉及大型复杂网络的一部分。在临床治疗中利用繁杂的单一目的miRNA抑制剂抑制相关miRNA表达和目标外泌体的包装过程，尽管都能取得一定的效果，却难以提供确切指导。而直接干预细胞外泌体的释放，难免对其他“货物”的运输产生影响，带来不良结局。而且尽管现在未在CRC中明确发现抑癌CAF外泌体miRNA，但已证实在胃癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤背景下，CAF的外泌体释放可以抑制肿瘤的进展和转移，降低肿瘤细胞对化学治疗的抗性。同时，CAF既是miRNA的供体，同时肿瘤细胞所分泌的许多外泌体要发挥效应也需要CAF的参与。因此，在不同种类的肿瘤及其肿瘤相关细胞中鉴定最佳的靶标miRNA及miRNA群具有重要意义，也是外泌体miRNA应用于临床的最大挑战。同时，对CAF中miRNA的深入研究不仅是为了设计针对miRNA的治疗方法，也是为了进一步了解CAF的性质和生物学特征，并且可能有助于探究针对CAF的其他治疗方法。