鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用

尹理君，廖申权，孙铭飞，宋忠峰1,，侯晓礁，李福元，吕敏娜，吴彩艳，李娟，林栩慧，蔡海明，胡俊菁，于林增，肖文婉，张健騑，戚南山 *，顾有方

(1. 安徽科技学院动物科技学院，安徽 凤阳 233100；2. 广东省农业科学院动物卫生研究所/岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640；3. 北京生泰尔科技股份有限公司，北京市中兽药工程技术研究中心，北京 100260)

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫引起的肠道寄生虫病，可严重影响受感染鸡群的增重和饲料转化利用率，雏鸡感染球虫时可造成高发病率及致死率，愈后鸡也存在生长不良，生产性能下降等问题，严重危害养鸡业的发展，据估计全球养鸡业每年因鸡球虫病可造成超过30亿美元的经济损失[1]。近年来，大规模集约化的饲养模式更加有利于鸡球虫的传播与感染，导致鸡球虫病发病率显著增高[2]。

自上世纪60年代，一些化学合成药物、聚醚离子载体类药物已被广泛应用于鸡球虫病的预防和控制，但因为抗球虫药的长期使用及一些不合理用药等情况，导致鸡球虫几乎对现有抗球虫药均产生了不同程度的耐药性，部分虫株甚至产生不同程度的交叉耐药现象[3]。鸡球虫耐药虫株的出现严重影响了抗球虫药物的使用效果，在田间虫株耐药性情况不清晰的情况下使用抗球虫药，极有可能造成鸡球虫病的大规模暴发。同时因抗球虫药的长时间使用，导致的药物残留问题严重影响家禽产品质量[4]。鸡球虫病活疫苗是目前可替代抗球虫药物防控鸡球虫病的重要方法之一，目前常用的鸡球虫病活疫苗主要包括强毒活疫苗和弱毒活疫苗。球虫强毒活疫苗是由强毒且免疫原性好的虫株，按一定的配比研制而成。强毒活疫苗由于其虫株毒力较强，存在散毒的风险，其使用存在一定的局限性[5]。而弱毒活疫苗是通过人为方法减弱艾美耳球虫虫株的致病性所得到的弱毒虫株而制成的活疫苗，它可以降低对宿主的危害，稳定性能好，安全性高，同时拥有着良好的免疫原性。目前关于鸡球虫病弱毒活疫苗的研制手段主要是通过理化致弱、鸡胚传代和早熟选育等方法，可获得致病力弱、免疫原性好的弱毒虫株[6]。鉴于国内缺乏相关致弱方法的系统性综述，本文旨在对球虫强毒虫株毒力的相关致弱处理方法及其在弱毒球虫疫苗研制中应用现状进行概述。

1 鸡胚传代致弱法

1.1 鸡胚传代的背景

国外学者Long[7]首先报道了柔嫩艾美耳球虫能在发育的鸡胚内生长，证明球虫在鸡胚中连续培养、传代能导致鸡胚适应株的产生。于1972年Long首次用鸡胚传代方法对野生型强毒株球虫进行毒力致弱处理，培育出柔嫩艾美耳球虫致弱株“TA株”。国内最早由杨振中等[8]学者采用鸡胚传代的方法对柔嫩艾美耳球虫(上海天山株)进行致弱处理，培养出了柔嫩艾美耳球虫致弱虫株，并于1984年完成了实验室研究，试制成弱毒活疫苗。Shirley[9]将毒害艾美耳球虫卵囊脱囊后获得的子孢子接种到鸡胚，并通过鸡胚反复传代，培育出第一个鸡胚适应株球虫，并发现该鸡胚适应株对鸡的致病性明显低于亲本株，但仍保留了良好的免疫原性。樊生超等[10]用鸡胚传代的致弱方法将柔嫩艾美耳球虫经过32代鸡胚传代，得到柔嫩艾美耳球虫实验虫株，通过鸡体毒力回归试验表明实验虫株与亲本株相比，其毒力明显降低，可用于制备鸡球虫病活疫苗的研究。谢明权等[11]用鸡球虫子孢子接种鸡胚，采用加大接种剂量和增加接种胚数的方法，使球虫逐渐适应鸡胚，传至24代，培育柔嫩艾美耳球虫体外繁殖鸡胚适应株。樊玉娟等[12]通过鸡胚传代对柔嫩艾美耳球虫传代条件进行研究，探究出了柔嫩艾美耳球虫的鸡胚培养条件并建立了柔嫩艾美耳球虫鸡胚适应株。

1.2 鸡胚传代的原理

鸡胚传代减毒的原理是通过人工措施使鸡球虫卵囊在体外达到脱囊效果，从而得到一定数量的子孢子，然后将子孢子接种到鸡胚绒毛尿囊膜上继续培养，繁殖得到更多的后代卵囊，将其孢子化后通过鸡胚连续传代多次，从而获得对鸡致病力大大降低、免疫原性好的“鸡胚适应株”[13]。其强毒株毒力得到致弱主要是由于第2代裂殖体从原来的黏膜固有层转而全部寄生到了肠腺上皮细胞，对组织损伤较小。

1.3 鸡胚传代的优势与局限

通过鸡胚传代的方法获得的鸡胚适应株，对雏鸡的致病力减弱，可使雏鸡抵抗强毒株的攻击。但其致弱性能相对不稳定，当转为鸡体传代时毒力返强较快。大批量生产商品化弱毒卵囊比较困难，如堆型、巨型艾美耳球虫等流行性强的球虫不易在鸡胚中发育，生产全价致弱疫苗会受到很大限制。同时随着鸡胚传代次数的增加，虫体的免疫原性可能会减少或完全丧失，很难获得既能保持良好的免疫力，又可以使毒力致弱的最佳虫株[14]。

2 理化致弱法

2.1 理化致弱的背景

早在1991年国外学者Jenkins等[15]发现用15 Krad X-射线和12 Krad γ-射线分别处理堆型和巨型艾美耳球虫卵囊，可明显减弱卵囊毒力，并发现用辐射减毒的卵囊免疫接种仍可以诱导鸡体产生保护性免疫反应。顾有方等[16]用重铬酸钾、氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖、氯化钾、叠氮钠和蒸馏水等制备了强毒鸡球虫致弱剂，可成功致弱柔嫩、堆型、早熟、巨型和毒害等艾美耳球虫。刘春杰[17]用物理方法和化学方法将柔嫩艾美耳球虫混合株致弱，首先将孢子化卵囊在一定功率不同超声时间的超声波作用下致弱，然后配制化学致弱剂，将孢子化卵囊和化学致弱剂搅拌混合均匀进行致弱，获得了柔嫩艾美耳球虫致弱混合株。刘蕾[18]以紫外线照射对柔嫩艾美耳球虫YL株进行致弱，发现经紫外线照射过的球虫卵囊相比未经过紫外线照射过的卵囊对鸡体的影响较小，症状和病理变化较轻,且没有死亡现象。李丹青等[19]采用双重致弱的方法，由柔嫩、毒害和巨型三种艾美耳球虫分离、纯化、培养后的孢子化卵囊采用烷化剂类化学诱变剂进行致弱后，又采用紫外线照射物理诱变因素再次进行致弱，得到双重致弱株，其诱变率高，毒力低，免疫效果稳定。

2.2 理化致弱的原理

理化致弱强毒株主要是通过冷却、加热、离子辐射、超声等物理或化学诱变剂等方式处理，使强毒株的毒力有所下降，从而达到减毒的目的。但因理化方法处理可能会造成卵囊的破壁、失活等，通过这些方式致弱处理可能是杀死了部分孢子化卵囊，减少了接种鸡体卵囊的实际数量，而非真正降低了艾美耳球虫的致病性，达到弱毒的效果。

2.3 理化致弱的优势与局限

通过理化致弱的方法产生的卵囊，毒力明显减弱，用减毒的卵囊进行免疫接种时，可以诱导宿主产生保护性免疫反应。但通过辐射处理得到的弱毒卵囊的裂殖发育阶段几乎完全中止，且随着辐射代次增加，卵囊的致病性会恢复正常。

3 早熟卵囊选育法

3.1 早熟选育的背景

早熟选育的方法最早是由Jeffers[20]提出并建立了早熟虫株的选育过程及相关研究方法的，随后通过此方法成功选育出了柔嫩、堆型、毒害、早熟、和缓和巨型艾美耳球虫等早熟弱毒品系。与亲本株相比早熟株毒力显著减弱，卵囊产量减少，内源发育周期中第三代裂殖体几乎完全缺失或数量减少。Shirley等[21]用分离出的布氏艾美耳球虫单卵囊进行鸡体传代，再用收取的潜隐期卵囊经过27代早熟选育，得到了生活史明显缩短的布氏艾美耳球虫早熟品系。王时伟[22]通过选择提前发育成熟的卵囊，获得布氏艾美耳球虫汤阴株的早熟株，经16代选育，最小潜隐期从119 h减少到90 h。索勋[23]按照早熟系选育方法对和缓艾美耳球虫涿州株进行了早熟选育，经石歧杂肉仔鸡15次传代后，潜隐期缩短了19 h，由亲本株的96 h缩短至77 h，其选育出的和缓艾美耳球虫涿州株早熟系在致病性与繁殖力上均较亲本株弱，但保留了亲本株的免疫原性。崔平等[24]通过对6株田间巨型艾美耳球虫早熟选育，经20次传代,获得了遗传性状稳定，潜隐期由156 h缩短至132 h的巨型艾美耳球虫早熟株。刘丽丹等[25]通过鸡体对和缓艾美耳球虫保定株连续11代的早熟选育后，获得了潜隐期由97 h缩短至82 h的早熟系。

3.2 早熟选育的原理

鸡球虫感染产生的卵囊在鸡体内连续早熟选育传代产生的虫株，由于裂殖期的裂殖代数的减少使球虫的生活周期可以快速完成，最后一代裂殖子的缺失或减少显著降低早熟品系的致病力，使得早熟株不仅具有生命周期缩短的特点，而且具有明显的毒力减弱的特征[26]。早熟选育法就是运用此原理用单卵囊分离法获得球虫卵囊，卵囊孢子化后接种雏鸡，收集感染后最先排出的卵囊，重复传代，不断选育获得早熟品系[27]。早熟株致病力减弱的原因是第二代裂殖体没有完全分化或在成熟时变得非常小，绝大多数只经历了1～3代的裂殖生殖，缺少完整的裂殖生殖阶段，在宿主中完成内生性发育比野生型亲本虫株更快，使之毒力变弱。

3.3 早熟选育的优势

早熟株与亲本株相比潜隐期明显缩短，致病力明显降低[28]。早熟品系的致病性明显低于强毒亲本株，随着连续数代的早熟选育，获得的早熟株减毒作用保持稳定；对于各种球虫的选育，持续传代，直到常规剂量下早熟品系对受感染鸡群的体增重没有影响或产生的影响非常微小。如Paracox-8疫苗，七种弱毒早熟株按照一定配比混合，对接种的鸡群也不会产生不良反应。

早熟株有着良好的早熟特性，能保持较好的免疫原性。廖贵城等[21]等对布氏艾美耳球虫进行了20代早熟选育，其致病力与繁殖力均比亲本虫弱,而免疫原性不变，并保持了遗传稳定性。张志敏等[30]通过研究选育了柔嫩艾美耳早熟株，并对早熟株和其亲本株卵囊的生物学特性进行了研究，结果发现，早熟株的免疫原性要好于亲本株。

4 致弱方法在鸡球虫病疫苗研发上的应用

1951年，第一个适用于种鸡和蛋鸡的商品化鸡球虫病强毒活卵囊疫苗Coccivac-D在美国上市,次年其研发出含有堆型、巨型、变位和柔嫩艾美耳球虫强毒株鸡球虫病活卵囊疫苗Coccivac-B。第二种商品化鸡球虫病活卵囊疫苗是1985年加拿大研发的Immucox-C1、Immucox-C2强毒活疫苗，Immucox-C1和Immucox-C2活疫苗均为未经致弱的自然毒力株按一定剂量配制的强毒苗，两者仅所含球虫种类稍有差异。由荷兰Intervet公司生产的强毒活疫苗Nobilis Cox包含有堆型、柔嫩和两种巨型艾美耳球虫，其通过饮水或喷雾接种肉鸡。英国Houghton实验室运用早熟选育的致弱方法于1989年成功研制出第一个鸡球虫病弱毒活卵囊疫苗Paracox-5和Paracox-8，前者包含柔嫩、堆型、和缓和两个不同的巨型艾美耳球虫早熟品系，后者是一种全价疫苗，包含了柔嫩、堆型、早熟、毒害、和缓、布氏以及两株不同免疫原性巨型艾美耳球虫早熟品系。捷克公司以鸡胚传代和早熟选育相结合的方法，于1992年研制出Livacox-T、Livacox-Q弱毒活卵囊疫苗，Livacox-T含有堆型和巨型艾美耳球虫早熟品系，同时含有柔嫩艾美耳球虫鸡胚适用品系，Livacox-Q与其相比增加了毒害艾美耳球虫早熟品系[31]。由澳大利亚BioProperties公司通过早熟选育的方法研制生产的Eimeriavax弱毒活疫苗，包含了柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球虫弱毒株，可通过滴眼的方法给予肉仔鸡、蛋鸡和种鸡。中国从20世纪80年代开始研究鸡球虫病弱毒活疫苗的研发，最早由中国农科院上海家畜寄生虫病研究所生产的鸡球虫病三价活疫苗是通过理化双重致弱的方法对柔嫩、毒害和巨型艾美耳球虫自然毒力株进行减毒，实现强毒株致弱的目的。由北京农学院研制的鸡球虫病三价活疫苗是运用早熟选育的方法进行致弱处理的，其含有柔嫩、堆型和巨型艾美耳球虫早熟品系，其研制的鸡球虫病四价活疫苗是包含柔嫩、堆型、巨型和毒害艾美耳球虫早熟品系。正典生物技术有限公司以早熟选育技术于2007和2012年分别研发了鸡球虫病四价活疫苗和鸡球虫病三价活疫苗，其鸡球虫病四价活疫苗包含了柔嫩、巨型、毒害和堆型艾美耳球虫四种早熟致弱品系，其鸡球虫病三价活疫苗与鸡球虫病四价活疫苗相比少了毒害艾美耳球虫早熟致弱品系。齐鲁青大生物制药有限公司于2016年上市鸡球虫病三价活疫苗(商品名为球贝)，该疫苗由柔嫩艾美耳球虫早熟弱毒株、巨型与堆型艾美耳球虫自然弱毒株混合制成[32]。于2019年获得新兽药证书的广东省农业科学院动物卫生研究所鸡球虫病四价活疫苗，是由柔嫩、毒害艾美耳球虫早熟减毒株和堆型、巨型艾美耳球虫自然弱毒株配比制成[33]，见表1。

表1 国内外商品化球虫疫苗

5 结语

目前，随着现代养鸡业规模化、集约化生产快速发展的同时，同样伴随着鸡球虫对各种抗球虫药产生耐药性，药物残留及药物生产成本高等问题，使用鸡球虫病免疫预防成为防控鸡球虫病的有效手段，其中鸡球虫病弱毒活疫苗有着致病力弱，稳定性能好，安全性高，免疫原性好等优点，使得球虫致弱虫株的选育成为弱毒疫苗研制的关键。由于鸡胚传代致弱和理化致弱的方法存在众多局限性，而通过早熟选育的方法获得的致弱虫株具有致病力弱、免疫原性好、遗传稳定等诸多优点,因此多数学者更倾向于利用早熟选育法进行球虫致弱虫株的选育。现阶段鸡球虫病的防控面临严峻挑战，研制高效、安全的鸡球虫病活疫苗将为养鸡业的可持续健康发展提供一定的保障。