补肾开窍祛痰方药对缺氧缺血性脑损伤大鼠能量代谢及神经细胞的影响

赵永刚 陈 昊 张洪兰

江苏省连云港市第一人民医院 222000

缺氧缺血诱导的再灌注损伤可导致脑性瘫痪、脑损伤、精神发育迟缓等神经性并发症，故缺氧缺血性脑损伤新生儿的神经保护是新生儿脑血管损伤疾病临床研究的热点之一。脑组织缺氧缺血所产生的系列异常级联反应，如脑组织能量元素失稳、神经细胞异常等均在缺氧缺血性脑损伤的神经功能缺损中起到重要的作用[1-3]。补肾开窍祛痰方来源于《备急千金要方》，近年来在治疗心脑血管疾病及其并发症中疗效显著[4]。但补肾开窍祛痰方对于脑组织能量代谢及神经细胞是否具有保护功能仍未见报道，本研究探讨补肾开窍祛痰方在缺氧缺血性脑损伤大鼠神经保护中的作用。

1 资料与方法

1.1 实验药物 补肾开窍祛痰方颗粒，配方：升麻、全蝎各10g，醋龟甲、制远志、紫河车、菟丝子各8g，鹿角胶12g，石菖蒲、熟地黄、益智仁各6g。委托华润三九医药加工成免煎颗粒，分装药品5g/袋。

1.2 动物分组和造模 SD大鼠(供货商：中科院生物学研究所；质量合格证号：SCXK(京)2017-0034；动物伦理审查证号：SP-DW-SMP-09-015-01)60只，体重在(200±1)g。按随机等分为模型组、正常组、假手术组、补肾方0.5倍组、补肾方1倍组、补肾方2倍组，每组10只。正常组不予任何处理，其余五组均进行手术造模。模型组、补肾方0.5倍组、补肾方1倍组、补肾方2倍组均采用Longa线栓+缺氧箱法进行缺氧缺血性脑损伤模型制备，制备方法为：麻醉后固定四肢，颈正中作切口，以尼龙鱼线对颈外动脉作栓塞缺氧处理(即采用尼龙鱼线作栓塞动脉处理，进线长度8～10mm，以无血流向大脑溢出为缺血造模成功)，并置入8%氧浓度密闭缺氧箱30min脑缺氧处理[5]。假手术组仅做颈外动脉游离处理，不做动脉结扎及缺氧箱处理。造模后观察大鼠生命体征情况，去除死亡大鼠(注：试验中模型组和补肾方1倍组各死亡1只)。

1.3 动物饲养、给药 各组动物正常饲养，饲养温度20～25℃，湿度为40%～70%，饲料为颗粒饲料(SCXK黑2018-008)，饮用水为灭菌水。模型组、正常组、假手术组不给予任何药物治疗，补肾方0.5倍组、补肾方1倍组、补肾方2倍组均于造模适应饲养3d(确定大鼠饮食正常)后分别给予临床等效0.5倍剂量[4.2g/(kg·d)]、1倍剂量[8.2g/(kg·d)]、2倍剂量[16.8g/(kg·d)]的补肾开窍祛痰方颗粒溶于灭菌水灌胃，连续治疗7d。

1.4 动物处理及指标收集 各组大鼠于饲养第8天处死并剥离脑组织于液氮中保存，并送华大基因检测室进行脑组织能量代谢指标及神经细胞检测。脑组织能量代谢指标包括一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)，采用高效液相色谱法测定，脑组织能荷值计算方法[6]：(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。神经细胞检测包括胸腺嘧啶核苷酸阳性细胞(BrdU阳性细胞)、嗅觉中枢阳性细胞(DCX阳性细胞)，采用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 给药7d后脑组织能量代谢指标比较 正常组和假手术组AMP、ADP、ATP及能荷值比较无显著性差异(P>0.05)。与正常组和假手术组比较，模型组、补肾方0.5倍组、补肾方2倍组均下降(P<0.05)，但补肾方1倍组无显著变化(P>0.05)。与模型组比较，补肾方0.5倍组、补肾方1倍组、补肾方2倍组均提升(P<0.05)，且补肾方1倍组显著高于补肾方0.5倍组、补肾方2倍组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠给药后脑组织能量代谢指标比较

2.2 给药7d后脑组织神经细胞比较 正常组和假手术组BrdU阳性细胞、DCX阳性细胞比较无显著性差异(P>0.05)；与正常组和假手术组比较，模型组、补肾方0.5倍组、补肾方2倍组均下降(P<0.05)，但补肾方1倍组无显著变化(P>0.05)；与模型组比较，补肾方0.5倍组、补肾方1倍组、补肾方2倍组均提升(P<0.05)；补肾方1倍组显著高于补肾方0.5倍组、补肾方2倍组(P<0.05)。见表2、图1～2。

图1 各组大鼠给药后脑组织BrdU细胞检测图

表2 各组大鼠给药后脑组织神经细胞比较个/cm3)

3 讨论

缺氧缺血性脑损伤在中医并未明确病名，可概述为因虚致瘀而损，故中医治疗可以益气化瘀、填精补肾、活血开窍为组方法则[7]。补肾开窍祛痰方药组成以醋龟甲、鹿角胶等10味中草药组方，其中醋龟甲、鹿角胶具备滋肾养血功效，增以熟地黄、紫河车的补肾填精功效，制远志、石菖蒲具有疏风祛痰功效，研究表明，远志根的提取物含寡糖及含皂苷等物质能明显提高对脑组织的保护效果；其次石菖蒲水提取成分能对脑皮质谷氨酸NMDA受体与配体结合，从而发挥对脑组织的保护作用，减少神经细胞损伤；并且研究表明，菟丝子、益智仁具有健脑开窍功效，菟丝子对小脑神经元也有保护作用，同时益智仁中的原儿茶酸能通过降低内源性抗氧化酶活性、抑制体内自由基的形成从而实现良好的神经保护作用，同时升麻、全蝎可引药入脑、提升疗效，全方可共奏益气化瘀、填精补肾、活血开窍、疏风祛痰的药效[8]。

在补肾开窍祛痰方对缺氧缺血性脑损伤大鼠脑能量代谢影响方面的国内外研究集中于能量代谢指标、神经细胞等方面。在脑组织血流完全阻断或不足情况下，脑组织能量代谢及能量元素离子的平衡会打破，磷酸腺苷会快速大量的增值，如磷酸腺苷类物质包括AMP、ADP、ATP等是局部代谢能荷指标的高表达会引起脑组织水肿、细胞坏死等[9-11]。神经细胞水平在缺氧缺血性脑损伤中产生重要重要作用，如BrdU细胞、DCX细胞等，其均是机体神经反应的重要效应因子。研究证实了脑组织能量代谢水平和神经细胞水平与缺氧缺血性脑损伤大鼠之间的关系[12-13]。本研究显示，中药治疗三个组大鼠脑组织能量代谢指标、神经细胞均得到改善，可见补肾开窍祛痰方药可显著改善缺氧缺血性脑损伤大鼠的脑组织能量代谢水平和神经细胞水平。另外，量效依赖性性补肾方1倍组大鼠的脑组织能量代谢指标、神经细胞改善效果最佳，提示补肾开窍祛痰方药在改善缺氧缺血性脑损伤大鼠的脑组织能量代谢和神经细胞水平中有一定的量效依赖性，补肾开窍祛痰方药颗粒推荐用药剂量(即1倍剂量)是最佳应用剂量。

图2 各组大鼠给药后脑组织DCX细胞检测图

综上所述，补肾开窍祛痰方可对缺氧缺血性脑损伤大鼠的神经功能损伤起到治疗作用，这可能与补肾开窍祛痰方可显著提示缺氧缺血性脑损伤大鼠的脑组织能量代谢和神经细胞水平有关。但补肾开窍祛痰方药应用于缺氧缺血性脑损伤新生儿的临床治疗具有一定的量效依赖性，因此临床应用必须谨慎，仍需大量前瞻性试验研究的进一步研究。