胶质瘤相关肿瘤基因同源3在恶性肿瘤中的研究进展△

张良强，王志刚，段睿#

1湖北民族大学附属荆门市第一人民医院肝胆胰外科，湖北 荆门 448000

2湖北民族大学医学部荆门临床医学院，湖北 荆门 448000

胶质瘤相关肿瘤基因（glioma associated oncogene，GLI）最初在 1987 年由 Kinzler等在人大脑胶质瘤中被检测出，因此而得名。1988年，Ruppert等鉴定出GLI家族包含3名成员[胶质瘤相关肿瘤基因同源1（glioma associated oncogene homologue 1，GLI1）、GLI2和GLI3]，均为含有CH型高度保守的锌指结构，能特异性识别并结合5'-GACCACCCA-3'DNA系列调控靶基因的转录，在人类发育、组织特异性分化及肿瘤中扮演着重要作用。GLI3定位于人7号染色体（7p13），该基因包含14个外显子，基因大小为8.5 kb，编码由1596个氨基酸构成的分子量约为190 kD的蛋白，在除了肾脏和脑组织以外的几乎所有正常组织中广泛表达。GLI3除了含有N-末端的转录抑制域和CH锌指结构域、C-末端的活性转录结构域等主要功能域外，中间还含有能调节核内转录的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic AMP-response element binding protein，CREB）、E3-泛素化连接酶的MID1（E3 ubiquitin ligase，MID1）、蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）及复合抑制物（supressor of fused，SUFU）等多种结合位点区域。已证实，GLI3的C-末端截短突变会导致肢端发育畸形。研究表明，GLI3在磷酸化、泛素化及甲基化的调控下能发挥相应的生理调控作用。其中，在接受蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）-糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）-酪蛋白激酶 1（casein kinase 1，CK1）的磷酸化或 Cu1/β-TrCP和Cu3/SPOP的E3-泛素化途径的调控下可发生C-末端截短转为分子量为83 kD的抑制刺猬（hedgehog，Hh）通路靶基因转录的GLI3阻遏形式（GLI3-repressor，GLI3R），不仅参与调节人T淋巴细胞和胎儿肝B淋巴细胞的发育成熟介导人体免疫应答，而且在Hh通路中通过调控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）通路与促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）-胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）通路促使人脐静脉内皮细胞中的白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、人趋化因子1（fractalkine 1，CXC-1）、人趋化因子2（fractalkine 2，CXC-2）及血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）等造血因子表达上调促进血管生成，也能激活人类多功能干细胞产生大量的造血祖细胞促进造血。Fu等还发现，在K436和K595处甲基化能分别增强保持全长形式的 GLI3（GLI3 full-length，GLI3FL）的稳定性和与DNA结合的能力，增强Hh通路活化作用，在恶性肿瘤的生长和转移中发挥明显致瘤作用。近年来，GLI3在多种恶性肿瘤中的作用备受关注，有望成为潜在靶点。本文结合文献就GLI3在恶性肿瘤中的相关研究进展作一综述。

1 GLI3与Hh 信号通路的关系

据报道，大约有25%源自内胚层的人类致命性肿瘤存在着Hh通路的异常活化。Hh信号通路激活是通过调控下游靶基因转录效应分子控制上皮细胞及间质细胞的相互作用，调控着肿瘤细胞增殖和分化行为。然而，Hh通路激活主要受制于负向调控元件的十二次跨膜蛋白Patched（Patch）和正向调控元件的七次跨膜蛋白Smothened（SMO）两种膜蛋白受体，且存在两种效应途径，其中，缺乏Hh配体（Indian Hh、Desert Hh、Sonic Hh）时，负向调控的十二次跨膜蛋白Patch与正向调控的七次跨膜蛋白SMO结合能抑制SMO的活化，此时负向调控元件的复合物SUFU与GLI2/3进行结合，通过磷酸化途径将其水解为主要的GLI3R，并使未入细胞核的GLI1完全降解，抑制下游靶基因转录；当存在Hh配体时，Hh配体与Patch受体结合后，Patch抑制SMO被解除，从而释放SMO，SUFU主要与GLI3R发生分离，进而使GLI3能保持全长，导致GLI1、GLI3FL共同进入细胞核，启动调节靶基因转录，调控细胞周期、细胞凋亡、迁移及肿瘤的恶性行为。在此过程中，GLI3表现出复杂的功能作用，即Hh通路异常激活的关键是存在GLI1和GLI3FL同时易位进入细胞核内，GLI3FL维持着GLI1转录活性的关键，且失去GLI3R后也是激活该通路的关键一步。

2 GLI3与恶性肿瘤的关系

2.1 GLI3与肺癌

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，其病死率也位居恶性肿瘤第一位，严重危害着全球人类的健康。Iwasaki等通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测102例Ⅱ～Ⅳ期肺腺癌组织标本中GLI1、GLI2、GLI3 mRNA的表达水平发现，高表达的GLI1或GLI3与Ⅱ～Ⅳ肺癌的不良预后相关，不同GLI1 mRNA（低表达vs高表达为 41.7% vs 20.0%，P=0.0074）、GLI3 mRNA（低表达vs高表达为43.1% vs 13.3%，P=0.0062）表达情况患者的5年生存期有差异，可见异常激活Hh通路存在着GLI1和GLI3促进肺癌进展。在机制方面，由Fu等实验发现，GLI3甲基化能增加GLI3的稳定性和与DNA结合能力，导致Hh信号过度激活（GLI1表达水平过度上调），且GLI3甲基化也有助于动物体内肿瘤及体外的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞的生长和转移。Liu等研究表明，在NSCLC细胞中miRNA-520B能靶向抑制GLI2和GLI3表达，通过抑制SPOP使两者的3'-UTR泛素化受到抑制，从而维持着GLI2和GLI3全长稳定，使Hh通路过度激活（主要表现为GLI1蛋白表达上调）和Bcl-2蛋白高表达，促进NSCLC细胞的增殖和转移。

2.2 GLI3与结直肠癌

结直肠癌发病率居全球恶性肿瘤第三位，病死率居第四位。Kang等研究表明，敲低GLI3表达的结肠癌细胞（RKO和LOVO）会出现肿瘤细胞生长受到抑制，细胞生长周期也停滞在G～M期，限制了肿瘤细胞的增殖行为，并能对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、奥沙利铂（oxaliplation，LOHP）和伊立替康（irinotecan，CPT-11）化疗药物产生耐受，同时发现其伴随着抑癌因子p53的表达上调。Trnski等研究发现，GLI3和GSK3β在人结肠癌组织中高表达；在结肠癌细胞中使用氯化锂干扰GSK3β，能增强GLI3-SUFU-GSK3β复合物的形成，促进GLI3发生裂解和抑制Hh通路激活（GLI1表达水平过度下调），此时，结肠癌细胞增殖行为降低并能诱导肿瘤细胞凋亡。可见，GLI3是一种结肠癌致癌因子，Hh通路的过度激活有赖于GLI3FL形成而发生致瘤，GSK3β通过微调GLI3保持GLI3FL状态发挥促瘤作用，此点可能为将来GLI3的恶性生物学行为、耐药及靶向治疗提供思路。

2.3 GLI3与肝癌

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，肝癌的发生与肝硬化进展有关。研究发现，在肝癌组织中GLI3的表达水平上调，其中miRNA-378a-3p表达与GLI3的表达呈负相关；同时在肝硬化动物模型中证明GLI3是一种重要的促肝纤维化因子，且miRNA-378a-3p能靶向GLI3表达抑制肝纤维化进展。虞玲华等研究也发现，GLI1与GLI3在肝细胞肝癌组织中较癌旁组织表达上调，GLI1与GLI3的表达呈正相关（r=0.432，P＜0.05），其中GLI1多提示不良预后，而GLI3也多集中在低分化的肝细胞肝癌中，两者很可能提示肝细胞肝癌的恶性行为。Zhang等研究发现，在肝癌组织中，肿瘤干细胞指示因子CD90阳性表达的肝癌中多伴有GLI1和GLI3表达上调，三者表达上调均与肝癌患者较短的生存期有关（P＜0.05）；敲低GLI1和GLI3的肝癌细胞能抑制伴有CD90阳性的肝癌干细胞株的迁移和球体形成能力，而在多组肝癌细胞株中发现，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信号转导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）水平伴随着下降；进行IL-6治疗反向证实，IL-6能部分逆转由GLI1和GLI3敲除引起的细胞增殖、球体形成能力和迁移能力的抑制。由此可见，GLI3参与肝癌的发生及进展，通过促进Hh通路异常激活及介导IL-6-JAK2-STAT3通路影响肝癌及肝癌干细胞的恶性行为。

2.4 GLI3与胰腺癌

胰腺癌是一种预后极差的恶性肿瘤，病死率居全球恶性肿瘤第七位。基于此，寻找胰腺癌的诊断和预后指标显得尤其重要。Ma等研究通过PCR检测结果显示，99例胰腺癌组织中GLI3 mRNA表达高于癌旁组织，其高表达与血管侵犯、远处转移及分化程度低有相关性；并且在胰腺癌细胞中GLI3与抑癌基因miRNA-494在胰腺癌细胞（PANC-1）中的表达也呈负相关；转染miRNA-494后胰腺癌细胞的活力和迁移能力降低，而转染GLI3后能恢复肿瘤细胞的活力和迁移行为，证实了GLI3促进肿瘤的作用，抑癌基因miRNA-494为其靶分子。此研究表明，GLI3可能成为胰腺癌一种预后及检测指标，而抑癌基因miRNA-494为抑制GLI3的靶基因，将为预后评估及治疗方面提供新的思路，但需要多中心研究支持。

2.5 GLI3与胃癌

Kageyama-Yahara等指出，人黏蛋白5AC（mucoprotein 5AC，MUC5AC）表达上调与胃黏膜肠化生相关，其研究发现GLI家族蛋白能调控MUC5AC的表达，而上调GLI1、GLI2、GLI3均能促使胃癌细胞MUC5AC表达量上升。Wang等发现，在280例胃腺癌组织中，GLI3阳性表达与脂质代谢分子的人酰基辅酶A硫酯酶1（acyl-coathioesterase 1，ACOT1）存在正相关；生存分析发现，胃腺癌组织中GLI3或ACOT1阳性的患者生存时间均较短，二者同时阳性表达患者的生存期更短，生存曲线面积更小，提示预后更差。同时，Wang的团队通过全基因图谱测序及分子谱分析发现，GLI3是胃癌的一种新的驱动基因。

2.6 GLI3与前列腺癌

Bragina等研究了Hh通路信号分子在人前列腺癌转基因小鼠模型中的作用，发现信号组件中仅音猬因子（snoic hedgehog，Shh）、GLI1和GLI3蛋白在人前列腺癌小鼠模型组织中高表达，并能促进前列腺癌的生长，而GLI2与之相反。机制方面，Li等研究发现前列腺癌细胞中存在一种Hh信号通路的非经典活化途径是GLI3与转录活性雄激素受体（androgen receptor，AR）结合产生相互作用，导致前列腺癌细胞的生长；其进一步在细胞转染AR的前列腺癌细胞中发现，GLI3FL/GLI3R比例明显升高，去除AR后肿瘤细胞中的GLI3FL/GLI3R比例反而下调。这一结果表明，前列腺癌中GLI3FL和AR表达水平呈正相关，GLI3FL和AR可能协同影响着前列腺癌的发生及进展，其具体机制有待进一步研究阐述。

2.7 GLI3与口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）

Rodrigues等研究发现，GLI3在OSCC组织和OSCC细胞系中均表达上调，而阳性表达也多集中在T/T期的侵袭性OSCC，并且GLI3高表达也多集中在生存期短的患者组织中。利用PCR阵列分析，比较GLI3在肿瘤干细胞指示因子CD44高和CD44低的OSCC细胞株（SCC4和SCC9）中的表达情况发现，CD44高的OSCC肿瘤干细胞中GLI3的表达量增加了6倍以上，提示着GLI3可能通过调控上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）导致肿瘤干细胞的活化，极有可能成为潜在导致肿瘤干细胞的一种靶基因。这一结论预示着，GLI3参与调控EMT促进肿瘤干细胞形成，发挥着促进OSCC的作用，为治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶点。

2.8 GLI3与其他恶性肿瘤

Natsumeda等研究发现，在人类髓母细胞瘤组织中GLI1和GLI3均高表达，二者表达均提示肿瘤分化程度低；其中，GLI3不仅在Hh异常激活的髓母细胞瘤中高表达，也在WNT信号激活的髓母细胞瘤中呈扩散式表达，而GLI1在WNT激活的髓母细胞瘤中表达受到抑制。这一研究提示着GLI3可能通过介导着Hh通路和WNT通路发挥恶性生物学行为作用，但需要进一步研究加以证实。Kurita等发现，GLI3能结合凋亡受体4（death receptor 4，DR4）抑制胆管癌细胞凋亡，利用siRNA干扰GLI3表达能恢复胆管癌细胞中的DR4与肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的结合诱导凋亡，而敲除GLI1和GLI2未发现此作用。Dai等研究指出，miRNA-140-5p是GLI3的直接靶基因；在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）细胞及其亲代细胞研究中发现，miRNA-140-5p上调能抑制GLI3的表达，且长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因 7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）的表达下调和miRNA-140-5p表达上调，能影响NPC细胞的集落形成行为、恶性增殖、诱导凋亡及抑制GLI3的表达，其机制可能为下调的SNHG7通过上调miRNA-140-5p抑制GLI3的表达，进一步抑制NPC细胞的增殖并促进其凋亡。在头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）细胞系研究中，GLI抑制剂（GANT61）和氯化锂（lithium chloride，LiCl）能降低HNSCC细胞的增殖能力和集落形成行为；其中，使用LiCl处理后，增强抑制GSK3β蛋白Ser9的磷酸化，使GLI3从全长形式到阻遏形式转化，从而抑制了HH-GLI通路活化。此点，为其临床应用提供一定线索。Bolze等关于绒毛膜癌的发生和免疫耐受性相关的760个基因组表达情况的研究中，在使用单一化疗药物（甲氨蝶呤或放线菌素D）治疗耐药性绒毛膜癌（n=34）与化疗敏感性绒毛膜癌（n=9）相比，其中仅有4个癌基因表达显著降低，其中就包括GLI3。此研究表明，GLI3是一种耐受化疗药物的致癌基因。但在另一项关于急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）的研究结果表明，GLI3下调是诱导AML耐药的潜在机制。为何会存在这种与多数恶性肿瘤相反的结果差异有待进一步研究探讨。

3 小结与展望

综上所述，GLI3在恶性肿瘤中多表现为一种致癌因子，与多数恶性肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡、侵袭及耐受化疗药物等相关，通过siRNA技术干扰GLI3表达能够影响肿瘤恶性生物学行为，可为恶性肿瘤的诊断、靶向药物治疗及疗效评价提供新的思路。目前GLI3研究多处于基础实验阶段，其致癌机制是可能通过与自身甲基化，泛素化作用，或与GLI1、黏蛋白MUC5AC及脂质代谢调节因子ACOT1等因子协同作用，或参与EMT、肿瘤干细胞形成，或通过介导Hh通路、IL-6/JAK2/STAT3通路、WNT信号通路等相关。然而，GLI3是否也通过以GLI3FL入细胞核启动靶基因转录致Hh通路过度活化发挥致癌，或是否存在Hh通路的其他信号分子共同调控恶性肿瘤发生发展，以及GLI3R是否也能促进肿瘤血管生成发挥促癌作用有待证实，且目前缺乏关于GLI3进行临床诊断和治疗的相关临床研究，以及其在AML中显示抑癌效应，需要进一步探究。鉴于GLI3的直接靶基因多为非编码 RNA（miRNA-520b、miRNA-494、miRNA-140-5p等），这些靶基因可能在未来抗癌药物的设计中提供思路。相信随着新的实验技术的不断应用、多个相关学科的综合发展及临床应用研究进一步探究，对GLI3的认识会越来越完整、准确，有望成为一种新的恶性肿瘤生物学靶分子。