磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B与基质金属蛋白酶9在铂耐药上皮性卵巢癌中的表达及意义△

刘坤，杨勇，付凤莲，王羽丰，杨梅，鲁凤丽

昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院1干疗科，2泌尿科，昆明 650118

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，仅次于宫颈癌和宫体癌，但病死率却居妇科肿瘤的首位。2018年全球有295 000例新病例和184 000例死亡病例。由于卵巢深居盆腔，体积小，缺乏典型症状，难以早期发现。大多数卵巢癌就诊时已为晚期，缺乏有效的根治方法，含铂方案化疗是主要的治疗手段，但易复发，5年生存率不足30%，患者一旦发生铂耐药，肿瘤细胞的生长及侵袭速度加快，死亡风险增加。铂类药物化疗耐药是治疗卵巢癌的主要障碍，严重影响卵巢癌患者的治疗效果及预后。因此，探讨铂耐药发生的潜在机制，研究卵巢癌耐药评估的方法对于提高卵巢癌的治愈率有重要的意义。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）家族是生长因子超家族信号转导过程中的重要分子，可被多种细胞因子和理化因素激活，激活的PI3K促使蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）蛋白活化。活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能（包括代谢、生长、增殖、存活、转录以及蛋白质合成）。AKT主要负责由PI3K始动的生物信息的转导，处于PI3K/AKT信号通路的中心环节，在细胞代谢、细胞周期调控以及生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用。正因为PI3K/AKT通路在肿瘤的发生、发展和治疗等方面都有着巨大潜力，其近年来也成为生物科学界的研究热点。有研究表明PI3K/AKT通路通过多种机制诱导肿瘤的发生；也有研究表明PI3K/AKT信号通路的激活有可能与人上皮性卵巢癌铂耐药的产生密切相关。本研究通过检测上皮性卵巢癌铂类敏感与铂类耐药患者血清中PI3K/AKT和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的水平，进一步分析其在耐药组内不同临床特征患者血清中的表达差异，探讨PI3K、AKT及MMP9的表达与铂耐药上皮性卵巢癌的关系和相关机制，为临床早期判断卵巢癌耐药提供相关的参考指标，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年9月至2018年9月在云南省肿瘤医院就诊的上皮性卵巢癌患者的病历资料。纳入标准：均为晚期卵巢癌；生存期≥3个月；肿瘤细胞减灭术后病理学检查确诊为上皮性卵巢癌；术后均采用以铂类为基础的联合化疗。排除标准：有化疗禁忌证或不愿意接受化疗；合并严重感染、严重精神障碍、神经系统疾病；接受过PI3K抑制剂等临床试验。根据纳入、排除标准，共纳入78例上皮性卵巢癌患者，按照2018年美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）卵巢癌指南定义分为卵巢癌铂耐药组（n=40）和铂敏感组（n=38），其中铂敏感组定义为初期采用以铂类为基础的化疗获临床缓解（临床症状消失，盆腔检查和B超检查均无包块，血清糖类抗原125值下降至正常），停药超过6个月未出现复发；铂耐药组定义为初期采用以铂类为基础的化疗达到临床缓解，但完成化疗后，在相对较短的时间内（即6个月之内）出现复发。铂耐药组中，年龄38～72岁，平均（51.70±7.18）岁；铂敏感组中，年龄32～79岁，平均（52.67±9.23）岁；两组患者年龄、临床分期、病理类型、组织学分级、淋巴结转移及脉管浸润情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 铂敏感组与铂耐药组患者的临床特征[n（%）]*

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 所有患者采用以铂类为基础的联合化疗6～8个疗程，直至疾病进展。

1.2.2 血清采集 清晨空腹采集治疗前患者的外周静脉血6 ml，静置0.5～1.0 h，在5000 r/min离心机下离心15 min，分离新鲜血清，取上清液，分装于-20℃冰箱保存，分批待检测。采用酶联免疫吸附法，严格按照试剂盒说明书步骤分别进行PI3K、AKT及MMP9的检测。每2个周期化疗结束后两周，通过CT等检查评价疗效。

1.2.3 疗效评价标准 所有入选患者均接受含铂方案化疗，治疗前后进行全面检查以评价治疗效果。采用实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）进行疗效评价。分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）。CR：所有目标病灶消失；PR：基线病灶长径总和缩小≥30%；PD：基线病灶长径总和增加≥20%或出现新病灶；SD：基线病灶长径总和有缩小但未达到PR，或有增加但未达PD。CR、PR、SD均视为治疗有效，PD则视为治疗无效。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PI3K、AKT与MMP9表达水平的比较

铂耐药组患者血清PI3K、AKT、MMP9水平均高于铂敏感组，差异均有统计学意义（t=2.78、2.16、2.23，P＜0.05）。（表2）

表2 两组患者血清PI3K、AKT与MMP9水平（±s）

2.2 不同临床特征铂耐药组患者血清PI3K、AKT和MMP9水平的比较

不同临床分期及有无淋巴结转移、脉管浸润的铂耐药组患者血清PI3K、AKT水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；组织学分级为G级、病理类型为透明细胞癌的铂耐药组患者血清PI3K及AKT水平分别高于组织学分级为G级及其他病理类型，差异均有统计学意义（P＜0.05）；临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移以及有脉管浸润的铂耐药组患者血清MMP9水平分别高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移以及无脉管浸润患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同组织学分级、病理类型的铂耐药组患者血清MMP9水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 不同临床特征的铂耐药组患者血清PI3K、AKT和MMP9水平（n=40）

2.3 血清PI3K、AKT、MMP9在铂耐药上皮性卵巢癌中的相关性

Spearman相关性分析显示，40例铂耐药上皮性卵巢癌患者外周血清中，PI3K与AKT表达呈正相关（r=0.472，P＜0.05），PI3K与MMP9表达无相关性（r=0.187，P＞0.05），AKT与MMP9表达呈正相关（r=0.431，P＜0.05）。

3 讨论

铂耐药一直是严重影响卵巢癌患者治疗效果和预后的幕后黑手。既可以是原发性铂耐药，也可能是继发性铂耐药，如果能发现潜在标志物可早期预测、分析铂耐药的发生机制，可能会提高卵巢癌患者的治疗有效率，延长患者总生存期。近几年，卵巢癌铂耐药的探索一直是研究的热点，从细胞信号转导到细胞内转运蛋白表达异常，从相关染色体变化、DNA修复基因改变、凋亡蛋白抑制因子的出现、谷胱甘肽S转移酶解毒作用增加，以及肿瘤细胞与细胞外基质的黏附和黏附能力的改变，从而引起细胞骨架重排、蛋白激活表达等均可能成为铂耐药的发病机制。

顺铂是治疗上皮性卵巢癌的常用药物，无论在辅助治疗还是姑息治疗阶段，其细胞毒作用主要通过形成铂-DNA络合物，破坏DNA结构，导致DNA损伤，诱导肿瘤细胞凋亡。细胞信号转导通路在铂耐药的发生机制中起到了非常明显的作用。铂-DNA络合物引发细胞中DNA损伤，导致细胞中相关信号转导通路被激活或者被抑制时，细胞的凋亡程序受到抑制，进而表现出对铂类化疗药物无反应，发生铂耐药或铂抵抗。

PI3K/AKT作为细胞内重要信号转导通路之一，参与很多重要的生物学过程的调控，其通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，并且此通路在肿瘤对放疗的抵抗、肿瘤细胞的发生与增殖以及侵袭与转移中关系密切。

MMP9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，能有效降解细胞外基质中的各种蛋白成分及基底膜中的Ⅳ型胶原纤维，破坏阻止肿瘤细胞侵袭转移的组织学屏障，从而引起细胞骨架重排、蛋白激活表达，在肿瘤细胞的侵袭转移以及铂耐药中起决定性作用。

有研究认为，铂耐药的发生与肿瘤细胞的信号转导密切相关。顺铂可以通过激活多种信号转导途径，激活凋亡信号引起DNA损伤，当信号转导被抑制时，细胞凋亡被抑制，表现出铂耐药或铂抵抗。还有研究表明，顺铂能够在多种肿瘤细胞中激活PI3K/AKT信号通路，使AKT下游蛋白磷酸化，PI3K抑制剂可以阻断这些现象，提高细胞对顺铂的敏感性。本研究发现上皮性卵巢癌铂耐药组患者血清PI3K、AKT水平均高于铂敏感组，进一步证实了PI3K/AKT信号通路在上皮性卵巢癌铂耐药中的作用。卵巢透明细胞癌是卵巢癌中恶性度较高的，也经常出现铂类药物耐药性的产生，且卵巢透明细胞癌中存在高频率的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunitalpha，PIK3CA）突变，运用PIK3CA基因靶向药物可能会对耐药透明细胞癌的治疗提供新的治疗方案。本研究也发现，在铂耐药组上皮性卵巢癌患者中，不同病理类型患者的PI3K及AKT水平不一样，其中透明细胞癌患者血清中PI3K及AKT水平高于其他病理类型的卵巢癌；组织学分级为G级的患者血清PI3K及AKT表达水平高于G级患者；研究还发现上皮性卵巢癌铂耐药组患者血清MMP9水平高于铂敏感组，表达水平在临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移及有脉管浸润患者中升高。进一步相关性分析显示，40例铂耐药上皮性卵巢癌患者外周血清中，PI3K与AKT表达呈正相关（r=0.472，P＜0.05），AKT与MMP9表达呈正相关（r=0.431，P＜0.05）。结果表明，PI3K/AKT信号通路在上皮性卵巢癌铂耐药中起着重要作用，活化的AKT通过激活下游靶蛋白如MMP9等抑制细胞凋亡，降低细胞对化疗药物的敏感性。

综上所述，PI3K、AKT及MMP9在铂耐药上皮性卵巢癌患者血清中高表达，且PI3K及AKT的表达水平与组织学分级和病理类型有关，MMP9表达水平与临床分期和淋巴结转移、脉管浸润有关；MMP9表达与AKT表达呈正相关。这些结果在临床实践中有着潜在的应用价值，外周血PI3K、AKT及MMP9高表达是否可以作为评估铂耐药的参考指标以及化疗前外周血PI3K、AKT及MMP9高表达的患者使用非铂类化疗或PI3K抑制剂是否疗效更好需要未来的研究去探索，为铂耐药卵巢癌患者探索有效的延缓和逆转耐药的新策略提供一定的依据。