氧化苦参碱通过抑制CHK1/2 磷酸化改善糖尿病大鼠肾组织的纤维化和炎症

李志阳，梁 丹，肖雅文，代云莉，艾福军，丁 菁，石明隽，肖 瑛，郭 兵

贵州医科大学基础医学院病理生理学教研室//贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，贵州 贵阳550025

糖尿病肾病（DKD）是终末期肾病的主要病因［1］。据统计，截止至2017 年全球糖尿病患者超过4.25 亿人。如果不采取干预措施，到2045年，全球患糖尿病的人数估计将上升至6.29亿［2］。而DKD是糖尿病的常见并发症和死亡原因［3］。近年研究认为肾脏血流动力学异常、氧化应激、糖脂代谢紊乱是其主要发病机制［4-8］。同时，炎症在DKD 的发生和发展中起着关键性的作用［9-12］。氧化苦参碱（OMT）是苦参中含量最高的生物活性物质，具有抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗肿瘤、抗纤维化等作用，广泛用于慢性乙型肝炎的治疗及肥胖、糖尿病等相关疾病的辅助用药［13-14］。本课题组前期研究发现，OMT对糖尿病大鼠肾组织的炎症反应和纤维化均具有一定抑制作用［14-16］。细胞周期检测点激酶（CHK）包括CHK1、CHK2，是G2/M期细胞周期检测点调控及DNA损伤修复的关键分子，能够阻止发生DNA损伤的细胞进入有丝分裂并协调参与DNA修复的各个过程［17-18］。既往研究多集中于CHK1和CHK2与肿瘤发生发展之间的关系，特别是在胃癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、血液肿瘤等肿瘤中CHK1和CHK2扮演着重要角色［19-23］。也有研究发现CHK1、CHK2可促进IL-1β和IL-6的分泌从而引起炎症反应，提示CHK1和CHK2可能与炎症和纤维化密切相关［24-25］，但关于CHK1和CHK2可否成为OMT治疗DKD的主要靶点的研究目前尚未见报道，因此本研究旨在探究OMT对DKD抗炎抗纤维化的可能作用机制是否是通过影响CHK1 和CHK2 的表达来发挥的？为寻找OMT抗炎抗纤维化的有效靶点提供一定的理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 SPF级8周龄SD雄性大鼠18只（北京华阜康有限公司）；大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞株（ATCC）。

1.1.2 药物与试剂 链脲佐菌素（STZ）（Sigma）；氧化苦参碱（南京广润生物制品有限公司）；β-肌动蛋白（βactin）（普美生物科技有限公司）；兔抗纤维连接蛋白（FN）（abcam）；鼠抗Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）（Sigma）；兔抗Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）（武汉三鹰生物技术有限公司）；鼠抗CHK1（博奥森生物有限公司）；兔抗CHK2（abcam）；兔抗p-CHK1（Ser345）（Cell Signaling Technology）；兔抗p-CHK2（Thr68）（博奥森生物有限公司）；ELISA试剂盒（Elabscience）；正常糖培养基（Gibco）；胎牛血清（PBS）（常州天地人和公司）；CHK1-siRNA、CHK2-siRNA（吉玛基因股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立与分组 SD大鼠适应性喂养1周后，采用完全随机设计将大鼠随机分为正常对照组（NC组）、糖尿病模型组（DM组）、氧化苦参碱治疗组（OMT组）。DM组与OMT组尾静脉注射STZ（55 mg/kg）复制糖尿病动物模型。3 d后若血糖≥16.7 mmol/L视为糖尿病模型复制成功［17］。造模成功6周后，OMT组给予腹腔注射OMT 120 mg/kg，1次/d，NC组与DM组给予等量等体积生理盐水，持续注射8周，每周监测1次血糖、体质量。实验期间动物自由进食饮水。所有操作均遵照实验动物伦理学要求（1900073）进行。

1.2.2 取材与生化指标检测 给药8周后处死大鼠。处死前，代谢笼收集24 h尿并用试剂盒检测尿蛋白；股动脉取血，离心取血清；试剂盒检测血糖、血肌酐，剩余血清置于-80 ℃保存待用；取双侧肾脏，部分固定于4%多聚甲醛溶液中用于组织切片，其余肾脏组织-80 ℃保存备用。

1.2.3 细胞培养与干预 NRK-52E细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的正常糖培养基，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，以备后续实验。OMT药物用量根据本教研室前期实验基础所得，为0.1 g/L。正常糖对照组（NG组）用1%NG培养（含1%胎牛血清的正常糖培养基，葡萄糖含量为5.5 mmol/L）；高糖模型组（HG组）用1%HG培养（含1%胎牛血清的高糖培养基，葡萄糖含量为30 mmol/L）；正常糖用药组（NG+OMT组）与NG组处理方式相同，同时用0.1 g/L OMT干预24 h；高糖用药组（HG+OMT组）与HG组处理方式相同，同时用0.1 g/L OMT 干预24 h；正常糖空载组（NG+con 组）用含1%NG 培养并转染阴性对照control-siRNA、正常糖敲低组（NG+siCHK1/2）用1%NG培养并转染CHK1/2-siRNA、高糖空载组（HG+con组）用1%HG 培养并转染阴性对照control-siRNA、高糖敲低组（HG+siCHK1/2）用1%HG培养并转染CHK1/2-siRNA。

1.2.4 肾组织HE染色、Masson染色 按试剂盒说明书操作。

1.2.5 ELISA 检测肾组织匀浆IL-6、IL-1β的水平 按BCA试剂盒说明书操作检测上清中蛋白浓度。ELISA试剂盒所测得IL-6、IL-1β浓度与上清中蛋白浓度之比为有意义值。

1.2.6 免疫组织化学染色检测肾组织中CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、蛋白的表达部位 采用SP二步法，将组织切片行脱蜡、水化、微波炉加热进行抗原修复；30 mL/L H2O2去离子水孵育，一抗CHK1（1∶100）、CHK2（1∶100）、p-CHK1（1∶100）、p-CHK2（1∶100），4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后，加相应二抗孵育，DAB显色，自来水充分冲洗、复染、脱水、封片，光镜下观察并拍照。

1.2.7 Western blot 法检测肾组织CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、FN、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ蛋白的表达水平取肾组织0.1 g，研磨后取上清。按BCA试剂盒说明书操作检测浓度，按比例加入5×的上样缓冲液，煮沸后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；转膜，50 g/L脱脂牛奶封闭。TBST洗膜后，分别加β-actin（1∶5000）、CHK1（1∶1000）、CHK2（1∶1000）、p-CHK1（1∶1000）、p-CHK2（1∶1000）、FN（1∶1000）、Col-Ⅲ（1∶1000）、Col-Ⅳ（1∶1000）。4 ℃冰箱，摇床上孵育过夜；洗涤后分别加入相应的二抗标记物，室温孵育1 h；用增强化学发光法显色，Tanon凝胶成像，经Image J软件分析后得到灰度值。

1.2.8 统计学分析方法 采用SPSS 21.0统计软件进行，各组间数据的计量资料均以均数±标准差表示。经单因素方差分析，方差齐时，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义；若方差不齐时，组间两两比较采用Games-Howell检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OMT对各组大鼠生化指标的影响

与NC组相比，DM组大鼠血糖（BG）、血肌酐（Scr）和24 h尿蛋白（24 h UP）均明显升高（P<0.05），经OMT治疗8周后，与DM组大鼠相比血糖、血肌酐和24 h尿蛋白均有所改善，但血糖仍未降至正常（P<0.05，表1）。

表1 各组大鼠血糖、血肌酐、24 h尿蛋白变化Tab.1 Changes of blood glucose,serum creatinine and 24 h urinary protein in each group(n=6,Mean±SD)

2.2 肾组织病理形态学变化

HE染色可见，NC组肾脏结构清晰完整；与NC组相比，DM组肾小球系膜细胞增生，肾小管萎缩，小管间质有炎性细胞浸润；与DM组相比，OMT组肾小球和肾小管病变程度明显减轻。Masson染色可见，与NC组相比，DM组肾小管间质胶原纤维增多；与DM组相比，OMT组胶原沉积显著降低（图1）。

图1 各组大鼠肾脏病理学变化Fig.1 HE and Masson staining for examining pathological changes of the kidney in each group(Original magnification:×400).Yellow arrows indicate the lesion site.

2.3 OMT对各组大鼠肾组织上清中炎症介质分泌的影响

DM组大鼠肾组织上清中IL-1β、IL-6的表达明显高于NC组（P<0.05）。给予OMT治疗8周后，与DM组相比IL-1β、IL-6的表达有所下降（P<0.05，表2）。

表2 各组大鼠肾组织上清中IL-1β、IL-6的表达水平Tab.2 Expression levels of IL-1β and IL-6 in the renal tissue of the rats in each group(n=6,Mean±SD)

2.4 CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2在大鼠肾组织蛋白中的定位及表达情况

NC 组大鼠的肾组织中，与DM 组、OMT 组相比CHK1、CHK2表达量无明显差异，但p-CHK1、p-CHK2表达量减少，DM组可见p-CHK1、p-CHK2表达明显增多，主要表达在肾小管胞浆和细胞核中，呈棕黄色，肾小球也可见少量阳性染色；而在OMT组中，p-CHK1、p-CHK2的表达较DM组明显减少，颜色变浅（图2）。

图2 免疫组织化学染色检测各组大鼠肾组织CHK1/2、P-CHK1/2的表达Fig.2 Expression of CHK1/2 and p-CHK1/2 in renal tissue of rats in each group detected by immunohistochemical staining(×400).Red arrows indicate positive expression.

2.5 Western blot检测各组大鼠肾脏中Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白的表达情况

与NC组相比，DM组Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明显增加（P<0.05）；与DM组相比，OMT组Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05，图3）。

图3 各组大鼠肾组织中Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白表达Fig.3 Col-III,Col-IV and FN protein expressions in the renal tissue of the rats in each group(n=6, Mean±SD).A:Western blots;B:Relative protein expression.*P<0.05 vs NC;#P<0.05 vs DM.

2.6 Western blot 检测各组大鼠肾组织中CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2蛋白的表达情况

在NC组、DM组和OMT组中CHK1、CHK2蛋白水平统计无差异。与NC组相比，DM组p-CHK1、p-CHK2蛋白水平明显增加（P<0.05）；与DM组相比，OMT组p-CHK1、p-CHK2蛋白水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05，图4）。

图4 各组大鼠肾组织中CHK1、CHK2蛋白表达Fig.4 Expression of CHK1 and CHK2 proteins in the renal tissue in each group(n=6,Mean±SD).A:Western blots;B:Relative protein expression.*P<0.05 vs NC;#P<0.05 vs DM.

2.7 敲低CHK1、CHK2后高糖培养的NRK-52E细胞中各蛋白的表达的影响

当CHK1/2敲低后，NG+siCHK1/2组各蛋白表达与NG+con 组相比无明显差异，与NG+con 组相比，HG+con组p-CHK1/2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明显增加（P<0.05）；与HG+con组相比，HG+siCHK1/2组各蛋白水平明显减少（P<0.05，图5）。

图5 敲低CHK1、CHK2高糖培养的NRK-52E细胞中各蛋白的表达Fig.5 Effects of CHK1 and CHK2 knockdown on protein expressions in NRK-52E cells exposed to high glucose(n=6,Mean±SD).A:Western blots of the proteins in cells with CHK1 knockdown.B:Protein expression of p-CHK1 relative to CHK1.C:Relative protein expression.D:Western blots of the proteins in cells with CHK2 knockdown.E:protein expression of p-CHK2 relative to CHK2.F:Relative protein expression.*P<0.05 vs NG,#P<0.05 vs HG.

2.8 OMT对高糖培养的NRK-52E细胞中各蛋白的表达的影响

与NG 组相比，HG 组p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN 蛋白水平明显增加（P<0.05），但CHK1、CHK2 蛋白水平无明显变化。在所有组中CHK1、CHK2表达水平无明显差异。与NG组相比，NG+OMT组各蛋白表达无明显差异，HG组p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明显增加（P<0.05）；与HG组相比，HG+OMT组蛋白水平明显减少（P<0.05，图6）。

图6 OMT对高糖培养的NRK-52E细胞中各蛋白的表达的影响Fig.6 Effect of OMT on protein expressions in NRK-52E cells cultured with high glucose (n=6, Mean±SD).A,B:Western blots.C:Relative protein expression.*P<0.05 vs NG.#P<0.05 vs HG.

3 讨论

DKD是糖尿病患者最常见且严重的并发症，是导致终末期肾病的主要原因［1］。近年来炎症一直是调节DKD过程重要的研究热点，广受学者关注。多位作者分别从炎症在DKD发展中的病理作用、表观遗传学对炎症和纤维化的治疗策略、表观遗传学与炎症的关系等方面进行综述［9，11,26］。当机体受到炎症持续刺激后，肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化（EMT），此时产生大量的α-平滑肌肌动蛋白形成肌成纤维细胞，肌成纤维细胞大量增殖，分泌纤维FN和Ⅰ-Ⅳ型胶原，造成过量的细胞外基质沉积，最后形成纤维化病变［16,28-29］。高糖诱导的NLRP3炎症小体激活介导了HK-2细胞的IL-1β分泌、caspase-1激活和细胞凋亡，且在高糖条件下，CD36、NLRP3 和IL-1β 表达水平（蛋白质和mRNA）均显着增加［27］。α-硫辛酸可下调糖尿病大鼠肾组织TLR4 和NLRP3炎症信号，减少炎性因子IL-6和TNF-α的表达和细胞外基质的沉积，从而减轻DKD炎症反应和纤维化病变的发生发展［29］。CHK1、CHK2是细胞周期检测点调控的关键因子。当机体受到多种内源性或外源性因子的威胁而发生DNA 损伤时，CHK1、CHK2 可使DNA 复制停滞在G2/M 期，进而引起一系列反应［22］。Xu等［24］在PM2.5引起的人支气管上皮细胞气道炎症与自噬的研究中提到了CHK1及其相关通路可诱导炎症的发生从而上调IL-6和IL-1β的水平；人碳酸酐酶Ⅱ复制的衰老模型中发现CHK2可促进IL-6等炎性因子的分泌［25］。我们的研究结果发现，CHK1/2在糖尿病大鼠肾组织中呈高表达，同时IL-6和IL-1β也呈高表达，提示在DKD中CHK1/2仍可能是促进IL-6和IL-1β分泌的主要因素，即CHK1/2可能是导致DKD炎症的重要因素。

OMT被普遍认为具有抗炎、抗纤维化、抗病毒、抗心律失常和抗肿瘤等广泛的药理作用，目前被作为治疗糖尿病的辅助用药［13,14］。本课题组前期研究发现，OMT具有显著地抗肾纤维化作用，其机制可能与下调DKD肾组织中促纤维化因子TGF-β1表达和抑制Arkadia泛素化降解SnoN蛋白，促进SnoN蛋白水平的恢复进而抑制TGF-β1/Smads信号通路的致纤维化效应相关［14］。OMT也可通过将Id2与Twist结合并影响其下游靶基因的转录激活，促进Id2逆转EMT并在糖尿病肾小管上皮细胞中发挥抗纤维化作用［15］。此外，OMT可抑制高糖介导的炎症反应和致纤维化作用。其机制可能与OMT降低血糖抑制PKCα的信号激活，减少TLR4蛋白表达进而使肾组织局部炎症因子的分泌减少，从而缓解

DKD纤维化病变的发生发展有关［16］。本研究结果中OMT的抗炎抗纤维化作用与上述报道一致，不同之处在于我们观察到CHK1/2除作为细胞周期阻滞的关键激酶外，可能还参与了炎症在DKD中的发生发展，可能是OMT减轻DKD炎症和纤维化的新作用靶点。且在体外实验结果部分我们看到，高糖培养的NRK-52E细胞中CHK1/2磷酸化水平上升，纤维化指标增多，敲低CHK1/2后纤维化指标减少，经OMT处理后CHK1/2磷酸化水平降低，同时纤维化指标降低，这提示OMT治疗纤维化的中间靶点可能是CHK1/2。

综上所述，OMT在糖尿病大鼠肾脏中发挥抗炎、抗纤维化的作用机制可能是通过抑制CHK1/2的磷酸化水平从而影响下游IL-1β、IL-6炎症介质释放及细胞外基质分泌增多来发挥作用的。本研究立足于课题组前期对OMT治疗DKD的作用机制的研究，寻找到OMT治疗的新靶点CHK1/2，探究了OMT对糖尿病大鼠肾脏抗炎抗纤维化作用的可能机制是通过抑制CHK1/2磷酸化来发挥的，为寻找OMT的作用靶点提供新思路，同时为临床应用OMT治疗DKD提供实验依据。后续我们将深入探究OMT是如何作用于CHK1/2，寻找其具体分子机制，明确CHK1/2作为OMT的靶点是如何起到抗炎和抗纤维化的作用。