COPD患者免疫细胞亚群特征及六味补气胶囊干预的分子机制

王小乐，朱 洁，高雅婷，吴 凡，杨勤军，童佳兵，张星星，王传博，吴 迪，李泽庚

安徽中医药大学1研究生院，2中西医结合学院，安徽 合肥 230012；3第一附属医院，安徽 合肥 230031；4安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所，安徽 合肥 230031；5安徽省教育厅重点实验室中医药防治肺系重大疾病重点实验室，安徽 合肥 230031;6安徽医科大学第二附属医院中医科，安徽 合肥230601

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见慢性炎症持续存在的呼吸系统疾病，归属中医“肺胀”、“喘证”等范畴，我国成人发病率高达8.6%，在疾病致死率中排第4位［1,2］。长期吸烟、空气污染等是导致COPD发生和持续进展的重要危险因素，可引起肺部巨噬细胞、中性粒细胞等的免疫相关细胞的异常活化，白介素-1β（IL-1β）、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子的大量释放，终致肺部反复的损伤与修复、肺泡结构破坏、气道和肺血管重构等改变［3,4］。因此，探究COPD肺部免疫细胞特征及其涉及的分子机制，对研究药物调控COPD免疫失衡机制具有指导作用。

中医认为肺气虚是COPD发病的根本所在［5,6］，基于新安医学“固本培元”理论，创制的六味补气胶囊可有效改善COPD患者肺功能，减少COPD的急性发作次数［7,8］，调节Th1/Th2平衡，提高血清Treg和IL-4表达，降低IFN-γ和IL-17水平,改善COPD的免疫紊乱和炎症状态［9］。实验研究表明，六味补气胶囊能显著降低COPD大鼠IL-1β、IL-10、TIMP1、MMP9等蛋白的表达，改善大鼠肺功能及肺部炎症反应［10,11］，但其对COPD相关的其它炎症免疫细胞调控机制有待探明。为此，本次研究通过挖掘COPD的单细胞转录组数据联合网络药理学方法，研究COPD肺组织免疫细胞群特征及六味补气胶囊干预COPD免疫失衡的可能分子机制，为进一步揭示六味补气胶囊对COPD炎症免疫调控机制提供基础。

1 资料和方法

1.1 数据库与软件

研究通过检索基因表达汇编（GEO）数据库获取COPD相关的单细胞转录组测序研究；中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）获取六味补气胶囊的主要活性成分及其靶向的基因；Rstudio加载R软件的Seurat包（版本：4.0.2）、clusterProfiler 包（版本：3.16.1）、ggplot2（版本：3.3.3）包进行数据分析和可视化。

1.2 六味补气胶囊活性成分及其靶点获取

通过TCMSP数据库检索并下载六味补气胶囊的组成方药（人参、黄芪、益智、玉竹、陈皮、肉桂）的主要成分及靶基因表。将获取的主要成分和靶基因表导入Rstudio中，通过设置口服生物利用度（OB）≥30%筛选后续研究所需的药物成分及其靶基因。

1.3 COPD的“免疫细胞亚群—差异基因”关系构建

检索并下载GEO数据库中COPD相关的单细胞转录组测序研究的临床样本信息和RawCounts稀疏矩阵，并加载到Rstudio软件中。制定研究个体纳入排除标准：（1）纳入的研究个体涉及正常对照或COPD；（2）去除与COPD个体年龄相差极大的正常对照样本。使用R软件从正常对照和COPD中各随机选取6个个体进行数据分析，使用R软件中Seurat包将数据转换为Seurat对象后，计算线粒体基因占比，以获取线粒体基因占比小于20%且转录本数大于1000且的细胞。对过滤后的数据进行整合、标准化、降维、聚类处理后，绘制正常对照和COPD的特征细胞图。下载研究中所有COPD与正常对照比较的各免疫细胞的差异表达基因矩阵，构建COPD的“免疫细胞亚群—差异基因”关系网络，用于后续构建“六味补气胶囊—免疫细胞亚群—靶基因”网络。

1.4 “六味补气胶囊—免疫细胞亚群—靶基因”网络构建

将COPD“免疫细胞亚群—差异基因”关系网络和六味补气胶囊的“活性成分—靶基因”网络导入R软件中，通过差异基因和靶基因的映射，构建“六味补气胶囊—免疫细胞亚群—靶基因”网络，分析六味补气胶囊中主要的活性成分所靶向的免疫细胞群和基因。

1.5 六味补气胶囊靶向免疫细胞亚群的机制预测

为研究六味补气胶囊靶向免疫细胞亚群的可能机制，首先提取“六味补气胶囊—免疫细胞亚群—靶基因”网络中的靶基因，使用R 软件clusterProfiler 包进行KEGG富集分析，获取靶基因富集的信号通路，以此推断六味补气胶囊调控免疫细胞的潜在分子机制，并使用ggplot2包对基因显著富集的前20条通路进行可视化，使用d3Network包绘制显著富集的前20信号通路及其富集的具体基因，寻找信号通路关联的主要基因。

1.6 COPD大鼠模型构建及六味补气胶囊干预实验

参考宋一平等复制COPD大鼠模型方法［12］，采用香烟烟熏联合脂多糖（LPS）气管滴注法构建COPD大鼠模型，造模及给药周期为28 d。清洁级SD大鼠（200±20 g）购自安徽医科大学动物实验中心，合格证号：SCXK（皖）2017-001。大鼠经1周适应性喂养后，随机分为正常组（n=6）、COPD组（n=6）、六味补气胶囊组（n=6）。其中COPD组和六味补气胶囊组于第1、14天行气道滴注200 μL LPS（1 mg/mL），且当天不给与烟熏，正常组给予等体积的生理盐水气道滴注，其余时间按1次/d烟熏，烟熏30 min/次。造模第3 周开始，六味补气胶囊组按人临床等效剂量给与六味补气胶囊混悬液灌胃（0.5 g/kg），其余各组给与等体积生理盐水灌胃，连续灌胃2周至造模结束。

1.7 大鼠肺功能和肺组织形态学评估

造模和给药结束后，大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉，采用AniRes2005动物肺功能分析系统检测各组大鼠的FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC值，以分析大鼠的肺功能；取大鼠肺组织，并经4%多聚甲醛固定后，随后脱水、包埋、切片等，HE染色法观察COPD大鼠肺组织的病理变化，并计算肺泡平均线性截距（AMLI），以评估肺泡结构改变。

1.8 血清ELISA及肺组织免疫组化检测

经腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min后取上层血清，ELISA法检测血清中IL1B、TNF-α、NF-κB表达；取大鼠肺组织，并经4%多聚甲醛固定，随后经脱水、包埋、切片等，免疫组化法检测大鼠肺组织IκBα（Bioss,bs-1287R；稀释比:1∶300）、JNK（proteintech，66210-1-Ig；稀释比：1∶1000）、c-JUN（Bioss,bs-0670R；稀释比：1∶300）、c-FOS（Bioss,bs-0469R；稀释比：1∶300）蛋白表达，验证六味补气胶囊对靶基因的影响。

1.9 统计学处理

采用IBM SPSS Statistics 23.0进行统计学分析，两组间细胞占比差异分析采用Wilcoxon秩和检验，正态分布数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05定义差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 六味补气胶囊的活性成分及靶基因

通过在TCMSP中检索并筛选到六味补气胶囊中各药物的181个主要活性成分及342个靶基因，其中人参、黄芪、益智、玉竹、陈皮、肉桂各药的主要成分及靶基因数如表1。

表1 六味补气胶囊各药物活性成分及靶基因数Tab.1 Active ingredients and their target genes in Liuwei Buqi capsule

2.2 COPD单细胞测序研究

本次研究纳入的COPD相关的单细胞转录组测序研究（GSE136831）包含28个正常对照、18个COPD，筛选后共纳入16个正常对照和18个COPD个体数据进行分析，各组男女性别各占一半。

2.3 COPD的“免疫细胞群—差异基因”关系网络

对正常对照和COPD患者个体的肺组织免疫细胞特征分析，结果发现两组个体肺组织中均检测到B细胞、T细胞、巨噬细胞，肺泡巨噬细胞等18个免疫相关细胞亚群（图1）。对各免疫细胞亚群占总细胞数比分析发现，与正常对照相比，COPD组巨噬细胞、cDC1、pDC、肥大细胞、T细胞、成熟树突状细胞占总细胞比差异均具有统计学意义（P<0.05，图2）。

图1 肺组织中免疫细胞亚群特征Fig.1 Characteristics of immune cell subsets in the lung tissue of COPD patients.

图2 肺组织中免疫细胞亚群占总细胞数量比Fig.2 Percentages of the immune cell subsets in the total cells.**P<0.01,*P<0.05.

2.4 六味补气胶囊调控COPD的“六味补气胶囊—免疫细胞亚群—靶基因”网络

六味补气胶囊中各药物组成靶向至少11种免疫细胞亚群的多个靶点，其中人参和黄芪所靶向的免疫细胞和靶基因排前2（表2）。

表2 六味补气胶囊靶向的免疫细胞亚群和靶基因Tab.2 Target immune cell subsets and genes of Liuwei Buqi capsule

2.5 六味补气胶囊调控免疫细胞群的功能

通过KEGG富集分析探究六味补气胶囊靶向免疫细胞群的作用机制，结果发现其靶向的基因主要富集于脂质和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、Toll样受体信号通路、TNF 信号通路等信号通路等信号通路（图3），通过分析前20 条通路的共有基因发现，其中CXCL8、IL1B、JUN、NFKBIA、MAPK8、FOS等多个基因富集于多条通路（图4）。

图3 六味补气胶囊靶向免疫细胞亚群相关基因的KEGG通路富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of targeted immune related gene of Liuwei Buqi capsule.

图4 富集于前20条通路及其靶基因Fig.4 Top 20 enriched KEGG pathways and their target genes.

2.5 六味补气胶囊对COPD大鼠肺功能及肺病理的影响

观察各组大鼠肺组织病理，结果发现，COPD组大鼠肺泡壁变薄、断裂、且炎性细胞浸润；六味补气胶囊组大鼠肺泡结构、炎性细胞浸润等均有所改善，且AMLI显著降低（图5）。与正常组大鼠肺功能比较，COPD组大鼠肺功能显著降低（P<0.05）；与COPD组大鼠肺功能比较，六味补气胶囊组大鼠肺功能有所降低，且差异具有统计学意义（图6）。

图5 各组大鼠（A）肺组织病理改变及（B）肺泡平均线性截距Fig.5 Pathological changes in the lung tissues (A) and alveolar mean linear intercept (B) of the rat models in different groups.**P<0.01.

图6 各组大鼠肺功能参数(A)FEV0.3(B)FVC(C)FEV0.3/FVC的变化Fig.6 Pulmonary functions parameters in each group,including FEV0.3 (A),FVC(B),and FEV0.3/FVC(C).*P<0.05.

2.6 六味补气胶囊对COPD大鼠血清IL1B、TNF-α、NFκB表达的影响

与正常组大鼠比较，COPD组大鼠血清IL1B、TNF-α、NF-κB水平显著升高；与COPD组相比，六味补气胶囊组大鼠血清中IL1B、TNF-α、NF-κB表达降低，且差异具有统计学意义（图7）。

2.7 六味补气胶囊对COPD大鼠肺组织IκBα、JNK、c-JUN、c-FOS蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，与正常组大鼠比较，COPD组大鼠肺组织JNK、c-JUN、c-FOS蛋白表达显著升高（P<0.01），IκBα表达显著降低；与COPD组大鼠比较，六味补气胶囊组大鼠肺组织IκBα表达显著升高，JNK、c-JUN、c-FOS蛋白表达显著降低（图7）。

图7 各组大鼠血清指标(A)IL1B (B)NF-κB(C)TNF-α水平Fig.7 Serum IL-1β (A),NF-κB (B),and TNF-α(C)levels in each group.*P<0.05.

3 讨论

既往研究表明，六味补气胶囊通过调控JAKs/STATs 通路相关蛋白的水平、调节Th1/Th2 细胞平衡等，改善COPD的炎症免疫异常［9,10,13］。此外，六味补气胶囊干预COPD的血浆和尿液代谢组研究发现，其可影响蛋白质、脂类等多种代谢物水平［14-16］，提示六味补气胶囊的多靶点特征。本次研究发现六味补气胶囊中各药物均有多活性成分和靶基因。为此，进一步挖掘COPD单细胞测序相关数据，以探究六味补气胶囊调控COPD炎症免疫细胞亚群可能的机制。

通过分析COPD相关免疫细胞亚群，结果发现巨噬细胞、T细胞等共18种免疫相关细胞。与正常对照相比，COPD中巨噬细胞、肥大细胞（Mast）、T细胞、树突状细胞（DC）等占比具有显著改变。研究表明，吸烟可激活巨噬细胞和肺泡巨噬细胞分泌TNF-α、CXCL1等炎性分子，但这些激活的细胞对细菌和凋亡细胞的吞噬作用却降低［4］，提示免疫细胞功能异常可能是COPD慢性炎症持续存在的重要机制。我们前期对COPD和正常人群的肺泡巨噬细胞差异基因研究发现，巨噬细胞的差异基因主要富集于细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路等，参与COPD的炎症免疫机制［17］，靶向肺巨噬细胞的相关通路可能是药物防治COPD的潜在策略［18］。GR等［19］研究发现，DC细胞可激活巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种免疫炎症细，与COPD的严重程度相关。我们研究发现相同免疫细胞具有大量的差异表达基因，为E此，进一步将六味补气胶囊的靶基因和COPD各免疫细胞的差异基因进行映射，以探究六味补气胶囊调控COPD炎症免疫反应的可能分子作用机制。

通过六味补气胶囊的靶基因和各免疫细胞差异基因的映射，结果发现六味补气胶囊的各药物均能靶向多个免疫细胞群的多个靶基因，靶基因显著富集于脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路等COPD密切关联的信号通路。其中，脂质和动脉粥样硬化是靶基因最为显著富集的信号通路。研究表明，全身性的炎症是引起血脂异常的潜在机制之一，在COPD血脂的异常发挥着重要的角色，亦有许多研究证实COPD 是动脉粥样硬化的独立预测因子［20,21］。因此，六味补气胶囊靶向免疫细胞亚群差异基因富集的脂质和动脉粥样硬化，提示其可能通过调控免疫炎症状态，延缓COPD的进一步进展。此外，显著富集的IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路与COPD炎症免疫均有相关性，Dhamodharan等［22］通过分析7个COPD相关的基因芯片研究发现差异基因亦显著富集于免疫炎症反应相关，其中Toll样受体信号通路与COPD的发病机制密切相关，且富集于该通路的CXCL9、CXCL10等差异基因可能是潜在的生物标记基因。IL-17通过与其受体结合，可激活NF-κB、PI3KAkt等多条信号通路［23］，参与低氧性肺动脉高压的病理机制［24］，它与TNF-α均为促炎因子，它们的高表达与COPD的支气管损伤受损相关［25］。六味补气胶囊靶向免疫细胞群的相关差异基因与炎症免疫反应导致的气道重构、肺动脉高压、动脉粥样硬化等相关，表明其可能通过改善COPD的炎症免疫，干预疾病的进展，从而发挥防治作用。

图8 各组大鼠肺组织IκBα、JNK、c-JUN、c-FOS蛋白免疫组化表达情况Fig.8 Immunohistochemistry expressions of IκBα,JNK,c-JUN,and c-FOS protein in the lung tissue of rats in each group.**P<0.01.

通过寻找关联富集通路间的靶基因，发现CXCL8、IL1B、JUN、FOS、NFKBIA、MAPK8是多条信号通路共有基因。CXCL8常被称为IL-8，研究表明吸烟可以诱导巨噬细胞、树突状细胞、气道上皮细胞等分泌IL-8，而IL-8 可招募中性粒细胞到达气道上皮细胞，促进MUC5AC和MUC5B的转录表达，参与COPD的进展［26］。IL1B是一个重要的促炎因子，由巨噬细胞、单核细胞等多种细胞分泌，可加重对慢性疾病的损害［27］，Yi等［28］研究发现IL1B在气道上皮细胞中表达显著升高。本次研究发现六味补气胶囊可显著降低COPD 大鼠血清中IL1B表达，可能是其改善COPD炎症状态的作用机制之一。MAPK8又名为JNK、JNK1等，研究表明ROS通过调节巨噬细胞中MAPK8/9的活性，调节自噬［29］，香烟烟雾提取物可通过激活JNK，引起血管内皮细胞的损伤［30］，我们研究观察到六味补气胶囊可降低COPD大鼠肺组织中JNK 的表达。NFKBIA 是NF-κB 的抑制分子，又名IκBα，Wu等［31］研究发现，颗粒物（PM）可激活NF-κB的表达，其可能机制与降低NFKBIA的表达相关。氧化应激反应可通过激活IκBα，而激活NF-κB，促进一系列IL1B、IL-8、TNF-α等炎性因子的释放［32］，通过比较血清中NF-κB 和肺组织中IκBα的表达，发现与COPD相比，六味补气胶囊可降低血清NFKB表达，且升高COPD大鼠肺组织IκBα表达，提示其对可能通过调节IκBα，影响NF-κB 表达，改善COPD 的炎症反应。JUN（又名c-JUN）和c-FOS是炎性转录调节因子AP-1的两个重要亚基。研究表明，吸烟干预小鼠肺组织AP-1的表达升高，香烟烟雾提取物可提高人类支气管上皮细胞中c-JUN和c-FOS的表达，导致c-JUN和c-FOS的细胞核富集，降低AP-1或其二聚体的表达可降低IL-6、IL-8、TNF-α的表达［33-35］。我们研究发现，六味补气胶囊亦可降低肺组织c-JUN、c-FOS蛋白表达。以上结果提示，六味补气胶囊靶向基因富集的通路的关联分子，可能是六味补气胶囊干预COPD炎症免疫失衡状态的主要靶点。

本次研究挖掘COPD肺组织单细胞转录组测序及六味补气胶囊的潜在靶基因，通过差异基因与靶基因的映射，最终发现六味补气胶囊防治COPD具有多靶点和多基因的特征，其可能通过干预COPD的多个免疫细胞亚群及相关靶基因发挥免疫炎症调控作用，并通过体内实验证实六味补气胶囊对IL1B、JUN、FOS、NFKBIA、MAPK8具有调控作用，但其主要调控的免疫细胞及作用机制有待深入的体外实验探索。这些潜在的免疫细胞亚群及靶基因为进一步探讨六味补气胶囊的免疫炎症干预机制研究奠定了基础，也为阐释中医药免疫调控机制研究提供一定的思路。