乳铁蛋白六肽降低人卵巢癌细胞的耐药性及其机制

刘 会，郭若文，徐 恰，刘力伟，刘 芸，秦宜德

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最致命的恶性肿瘤，目前临床上使用的治疗方法仍然是手术结合化疗，但是由于卵巢癌极易复发和容易产生耐药性，所以其预后很差，患者的5年生存率只有30%左右，降低卵巢癌对化疗药物的耐药性是当前针对卵巢癌治疗的主要研究方向。乳铁蛋白六肽(lactoferrin hexapeptide，LfcinB 4-9)来源于牛乳铁蛋白抗菌肽(bovine lactoferricin，LfcinB)，是乳铁蛋白抗菌肽的活性中心，具有多种生物学活性，其序列为RRWQWR。前期研究显示LfcinB 4-9具有抗卵巢癌的作用，虽然作用效果不及目前临床上一线抗癌药物-顺铂(cis-dichlorodiammine platinum，DDP)，但其没有副作用和耐药性而广受关注。LfcinB 4-9和DDP联合使用能否降低卵巢癌细胞的耐药性，增强卵巢癌对DDP的敏感性仍有待探讨。该研究在前期研究的基础上，通过LfcinB 4-9和DDP联合作用对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响来探索LfcinB 4-9能否改善卵巢癌细胞对DDP的耐药性。

1 材料与方法

1.1 材料

纯度为99.8%的LfcinB 4-9由上海生工公司合成；RPMI-1640培养基、DMEM 培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(FBS，上海四季青公司)；DDP(江苏南通诺欣药业公司)；Olaparib(D1810190，上海阿拉丁公司)；逆转录试剂盒(K1622，美国Thermo Fisher公司);qRT-PCR试剂盒(A6001，美国Promega公司)；Transwell板(美国Costar公司)。

1.2 细胞培养

人卵巢癌细胞株SKOV3、SKOV3/DDP、CI3K、CI3K/DDP均购于中科院细胞库。SKOV3、SKOV3/DDP使用FBS浓度为10%的DMEM培养基，加入1%的双抗，置于37 ℃、5% CO培养箱中培养。CI3K、CI3K/DDP使用FBS浓度为10%的RPMI-1640培养基，加入1%的双抗，置于37 ℃、5% CO培养箱中培养。

1.3 细胞增殖实验

将细胞接种于96孔板，每组6个复孔，培养过夜后。分为8组：对照组、5 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC)组、DDP(IC)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC)+5 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9组，Olaparib(IC)组、DDP(IC)+Olaparib(IC)组，分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT置于培养箱中孵育4 h。使用酶标仪检测吸光度(optical density,OD)值，以空白为对照组，按照计算公式：增殖抑制率(%)=(1-OD/OD)×100%，计算卵巢癌细胞增殖抑制率。

1.4 HE细胞染色观察细胞形态

将爬片用高锰酸钾浸泡过夜、灭菌、烘干置于6孔板底部，将细胞消化成细胞悬液，铺在6孔板底部制成细胞爬片，过夜。按照分组加药培养48 h，弃去培养基，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定细胞20 min,PBS洗涤3遍，加入0.7% Triton X-100通透10 min后，PBS洗涤3遍。去离子水洗涤2遍，苏木精染色7 min，50 ℃水蓝化4 min,伊红溶液染色5 min，最后清水洗涤干净，烘干封片拍照。

1.5 平板克隆形成实验

将细胞以1 000个每孔铺于6孔板中，每组设置3个复孔，按照分组加药培养，每2 d更换1次培养基，培养2周。将培养基弃去，用PBS洗涤3遍，用4%的多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色，清水洗涤干净拍照，以对照组计算克隆抑制率，公式为：用药组克隆抑制率(%)=1-(用药组形成的克隆数/空白对照组形成的克隆数)×100%。

1.6 Transwell实验

将BD基质胶按照比例配置好加入小室中，置于细胞培养箱中待凝固，将2×10个细胞重悬于100 μl无血清培养基中加至Transwell小室膜上，在小室下方加入含10% FBS的培养基500 μl，每组设置3个复孔，置于培养箱中培养24 h，用PBS洗涤小室2次，用4%的多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色，清水洗涤干净拍照。

1.7 qRT-PCR实验

按照分组处理细胞48 h，消化收集、裂解细胞，提取细胞中的总RNA。按照逆转录试剂盒中操作步骤采用两步法将RNA逆转录成cDNA，包括总RNA 2 μl、Oligo(DT) 2 μl、水9 μl，65 ℃反应5 min,置于冰上。加入5×RB 4 μl、RI 1 μl、dNTP(10 mmol/L) 2 μl、RT 1 μl,最终体积为20 μl，逆转录反应条件为42 ℃、60 min，70 ℃、5 min，生成cDNA，并以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒配置反应体系加入到八连管中，按照3步进行反应：95 ℃预变性300 s，以95 ℃变性20 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s进行40个循环。每组设置3个复孔，以β-actin引物为内参，目的引物序列见表1，根据实验结果获得Ct值,以2公式计算基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR 引物序列

2 结果

2.1 LfcinB 4-9对DDP抑制卵巢癌细胞增殖作用的影响

DDP、Olaparib作用于4种细胞各时间段的IC见表2。通过不同浓度的LfcinB 4-9和DDP IC联合作用于人卵巢癌细胞，以Olaparib作为阳性对照，结果表明细胞的增殖抑制率随着LfcinB 4-9浓度增大而显著增高，表现出与时间呈依赖关系(

F

=841.1、

F

=474.5、

F

=614.2、

F

=290.5)。LfcinB4-9联合DDP组与单独使用DDP组比较差异有统计学意义(

P

<0.05或

P

<0.01)。见图1。

图1 MTT检测联合用药对4种细胞增殖能力的影响A：SKOV3；B：SKOV3/DDP；C：CI3K；C：CI3K/DDP；a：对照组；b：5 μmol/L LfcinB 4-9组；c：DDP(IC50)组；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9组；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9组；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9组；g：Olaparib(IC50)组；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)组；与对照组比较：**P<0.01;与DDP(IC50)组比较：#P<0.05，##P<0.01

表2 DDP、Olaparib作用于4种细胞各时间段的IC50(mmol/L)

2.2 LfcinB4-9对DDP诱导卵巢癌细胞的凋亡和坏死的影响

通过HE细胞染色切片观察细胞形态变化，实验结果显示LfcinB4-9联合DDP组与单独使用DDP组相比，更能诱导细胞凋亡和坏死。LfcinB4-9联合DDP组的SKOV3、SKOV3/DDP、CI3K、CI3K/DDP人卵巢癌细胞经染色均表现为核蓝浆红, 核大深染, 细胞核/细胞质比值增大。其中CI3K、CI3K/DDP细胞的胞核及胞质着色较于SKOV3、SKOV3/DDP细胞深, 耐药株细胞较于不耐药株细胞染色颜色更偏紫红，见图2。

图2 HE细胞切片实验检测联合用药对人卵巢细胞形态的影响 ×100A:SKOV3 ;B:SKOV3/DDP ;C:CI3K ;D:CI3K/DDP； a：对照组；b：5 μmol/L LfcinB 4-9组；c：DDP(IC50)组；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9组；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9组；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9组；g：Olaparib(IC50)组；h：DDP(IC50)+ Olaparib(IC50)组

2.3 LfcinB 4-9对DDP抑制卵巢癌细胞克隆形成的影响

实验结果显示与对照组比较，加药组细胞克隆形成能力显著降低，且LfcinB4-9联合DDP组与单独使用DDP组比较差异有统计学意义(

P

<0.01)，见图3。

图3 平板克隆实验检测联合用药对人卵巢细胞细胞克隆形成能力的影响 ×100A：对照组；b：5 μmol/L LfcinB 4-9组；c：DDP(IC50)组；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9组；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9组；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9组；g：Olaparib(IC50)组；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)组；与对照组比较：**P<0.01;与DDP(IC50)组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.4 LfcinB 4-9对DDP抑制卵巢癌细胞侵袭能力的影响

通过Transwell实验检测细胞侵袭能力，结果显示加药培养细胞48 h后，和单独使用DDP组比较，LfcinB4-9联合DDP组细胞侵袭能力明显下降(

P

<0.01)，见图4。

图4 Transwell实验检测联合用药对人卵巢细胞侵袭能力的影响 ×100A：对照组；b：5 μmol/L LfcinB 4-9组；c：DDP(IC50)组；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9组；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9组；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9组；g：Olaparib(IC50)组；h：DDP(IC50)+ Olaparib(IC50)组；与对照组比较：**P<0.01;与DDP(IC50)组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.5 LfcinB 4-9对人卵巢癌细胞的OPTN、HSF1、HSP70基因表达的影响

用qRT-PCR检测人卵巢细胞中OPTN、HSF1、HSP70的mRNA水平。结果显示，OPTN基因在联合用药组的表达水平低于单独使用DDP组(

P

<0.05或

P

<0.01)，HSF1和HSP70在联合用药处理后表达量明显降低且低于单独使用DDP组，表明在联合处理后相关基因表达均被抑制。在SKOV3、SKOV3/DDP细胞株中基因表达量比在CI3K、CI3K/DDP细胞株中略高。见图5。

图5 联合用药后四种细胞中OPTN、HSF1、HSP70基因的表达情况A:SKOV3;B:SKOV3/DDP;C:CI3K;D:CI3K/DDP； a：对照组；b：5 μmol/L LfcinB 4-9组；c：DDP(IC50)组；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9组；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9组；f：DDP(IC50)+50 μmol/L LfcinB 4-9组；g：Olaparib(IC50)组；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)组；与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01;与DDP(IC50)组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

DDP是目前临床上治疗卵巢癌通用的一线药物，但由于耐药性的出现，使得治疗效果降低，临床上卵巢癌病死率逐年递增。所以急需降低卵巢癌对顺铂的耐药性，提高患者生存率。

本实验显示不同浓度的LfcinB 4-9与DDP的IC联合作用于人卵巢癌细胞，结果表明，LfcinB 4-9可以增强DDP对人卵巢癌细胞的作用，提高卵巢癌细胞对DDP的敏感性，但相关的具体机制比较复杂，还需要进一步探索。化疗耐药是一种多基因多水平多种因素共同作用的过程，有多种细胞信号传导分子和途径涉及药物耐药性，其中包括多药耐药基因(

MDR

1)、Bcl-2蛋白家族、AKT等凋亡相关基因。相关研究表明

MDR

1在肿瘤细胞中的高表达是产生肿瘤耐药性以致化疗失败的重要原因，

MDR

1编码一种跨膜相关的糖蛋白，类似于ATP依赖性的外排泵能够将细胞内的药物泵出体外，从而提高细胞耐药性，而

OPTN

基因的表达下降或不表达能够影响

MDR

1基因的表达上升。Bcl-2蛋白家族可以通过抑制毒性刺激后的细胞凋亡来诱导化学疗法的耐药性，从而防止细胞死亡。相关研究显示，Bcl-2-a1在细胞系中的过度表达可增强对不同癌症药物的耐药性，而

OPTN

基因的表达下降或不表达能够影响Bcl-2基因的表达上升。

AKT

基因参与线粒体介导的各种途径的细胞凋亡, 通过磷酸化或者直接作用于细胞死亡因子来调节细胞凋亡。而相关研究表明

OPTN

基因可能通过抑制AKT蛋白表达, 从而借助于PI3K/AKT途径促进肿瘤细胞的凋亡。其具体机制有待进一步研究。人

OPTN

基因位于10号染色体上，由5′UTR中的3个非编码外显子和13个外显子组成，其表达的蛋白OPTN有577个氨基酸，大小为66 ku。OPTN具有膜运输、维护高尔基体、胞吐作用和蛋白质分泌、细胞分裂控制等多种作用，在有关研究中OPTN被鉴定为选择性自噬受体，可与多泛素化的底物结合，并将它们带到和微管相关蛋白1的轻链3(microtubule-associated protein 1 light 3，LC3)相互作用区的自噬体，可用于清除药物、受损的线粒体和在ER处降解蛋白簇等功能。从公开可用的人类癌症数据中查找到，

OPTN

基因在癌细胞均高表达，这与患者的生存率降低有关，同时也可能使

OPTN

成为有吸引力的治疗靶标，对于肿瘤发生或肿瘤干性，在Ser177处OPTN的磷酸化起着关键作用，并在有丝分裂中起到巨大作用且诱导OPTN易位进入核，从而克服耐药性和更具攻击性的癌症，本实验中研究

OPTN

基因对卵巢癌细胞的增殖与耐药机制的影响，并从实验结果中可以看出

OPTN

基因的表达抑制了肿瘤细胞的增殖，降低了肿瘤细胞的耐药性，将为临床上的治疗提供重要理论依据。

热休克蛋白家族(heat shock proteins，HSP)是转录程序中主要的调控因子，作为分子伴侣，促进其他蛋白质的折叠、组装、运输和降解。相关研究表明热休克因子1(heat shock transcription factor1，HSF1)、热休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)在卵巢癌细胞中的高表达可能与癌症的形成与转移密切相关，HSF1、HSP70在癌细胞中的高表达可能通过提供对化学疗法的抗性而导致肿瘤发生和转移，在相关研究中表明HSF1不仅借助于保护癌症中的蛋白质稳态而起着一般促癌因子的作用，并且还起到破坏蛋白质稳态和引起淀粉样蛋白生成，可能是对抗恶性肿瘤的一种新型治疗策略。HSP则可以通过外泌体被分泌到细胞外。胞外的HSP不仅可以通过外切体介导的传输诱导促炎性细胞因子，也可以抑制蛋白质错误折叠和聚集在受体细胞，通过HSP的非细胞自主作用，HSF1可通过产生炎性微环境并维持肿瘤的整体蛋白质组学稳定性来促进肿瘤进展。

由于LfcinB 4-9对正常细胞无毒性且来源广泛，因而在临床上有广阔的应用前景，也为卵巢癌化疗辅助药物研发提供了新的方向。