产甘油假丝酵母启动子优化

2021-11-08杨海雁于喆源

生物化工 2021年5期

杨海雁，于喆源

（张掖市质量检验检测研究院，甘肃张掖 734000）

甘油是一种重要的轻化工原料，具有吸湿性强、粘度高、冰点低等特点[1-2]。据报道，甘油作为原料有2 000多种用途，应用于十多个行业，其中在食品工业中通常作乳化剂、甜味添加剂、保湿物质等，在医药工业中用于溶剂和润滑剂，在国防工业中用以制备硝化甘油、生产炸药或添加到燃料中作为抗冻剂[3-4]。按生产方式不同，甘油主要分为天然甘油、化学合成甘油、微生物发酵甘油3种。近年来研究发现，在特定的培养条件下，许多微生物，包括细菌、酵母、霉菌、原生动物和藻类等均能合成甘油[5-6]，其中利用耐高渗透压酵母发酵生产甘油的方法研究较为广泛。该方法的主要特点是酵母可在较高糖浓度及有氧条件下生长发酵，不需要加入转向剂，糖的转化率可高达60%[7-8]。本文通过优化产甘油丝酵母的启动子，使得产甘油假丝酵母更加高效的表达，从而增加甘油的产量，产生更大的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌JM109、产甘油假丝酵母WL2002-5，由本实验室保存；Tryptone、Yeast Extract，购自Oxoid公司；YPD培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；T-Vector pMD19（simple）、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶，购自大连Takara公司。

1.2 仪器与设备

MJ Mini型PCR仪，美国伯乐（Bio-Rad）公司；HITACHICR22G型低温高速离心机，日本HITACHI公司；Electroporator 2510型电转仪，德国Eppendorf公司；GelDoc-It310型UVP凝胶成像仪，英国UVP有限公司；DYCZ-40D型琼脂糖凝胶水平电泳仪，北京六一厂；BK-FL型荧光显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计

根据pCAMBIA1302质粒中GFP编码基因设计引物STL1、STL2，为了利于将PCR片段连接到质粒pGAPZB上，在上游引物STL2的5’端添加EcoRⅠ酶切位点，在下游引物STL2的5’端添加SacⅡ酶切位点[9-11]；利用DNAMAN进行引物设计，序列如表1所示。

表1 引物序列

1.3.2 PCR体系及反应条件

PCR体系具体的材料组成见表2，反应条件[12]见表3。

表2 PCR体系组成

表3 PCR反应条件

1.3.3 菌体收集

将实验室保存的产甘油假丝酵母野生菌株在YPD培养基中培养23 h，转接后制作感受态，用“电转化”和“一步法”将质粒pET-STL1-gfp-zeocinrDNA、pET-STL2-gfp-zeocin-rDNA转入到产甘油假丝酵母感受态中，涂布含有zeocin的YPD平板，在30 ℃烘箱中培养36 h，挑取一部分菌落在YPD培养基中30 ℃，200 r/min摇瓶培养36 h，收集在显微镜下有荧光的菌体。

1.3.4 绿色荧光蛋白的检测

挑取重组产甘油假丝酵母单菌落接种于10 mL YPD培养基中，30 ℃、200 r/min 振荡过夜，然后1∶100的接种量分别接种于50 mL YPD培养基中，摇瓶培养至OD600值约为0.9，置于4 ℃冰箱中数小时至过夜，室温下8 000 r/min离心1 min，收集菌体沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次后，重悬于100 μL PBS缓冲液中。取5～10 μL菌液涂片，在Olympus BX50荧光显微镜下观察，同时用SONY 3CCD的Color Video Camera 拍照[13-15]。

2 结果与分析

2.1 质粒构建流程图

质粒构建的过程如图1所示。

图1 质粒构建流程

2.2 STL1、STL2启动子PCR电泳图

PCR扩增完成后，使用琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图2所示。图2显示STL1、STL2启动子PCR条带明亮、边界清晰，表明两条启动子扩增成功。

2.3 荧光显色

将质粒pET-STL1-gfp-zeocin-rDNA、pET-STL2-gfp-zeocin-rDNA转入到产甘油假丝酵母感受态中，经培养后，接种到含10%、20%、30%、40%、50%葡萄糖的YPD中，利用荧光显微镜观察不同渗透压下荧光强弱，结果如图3和图4所示。

图3 目的菌株（STL1）和野生菌荧光蛋白图

图4 目的菌株（STL2）和野生菌荧光蛋白图

图3、图4表明将目的基因电转入产甘油假丝酵母中，通过涂含有zeocin的YPD平板，得到稳定的阳性转化子，在有梯度的YPD培养基中培养，进行荧光观察，显示有荧光，说明STL1、STL2启动子在产甘油假丝酵母中诱导显色基因gfp进行了表达，表示试验取得了成功；且根据与野生菌株荧光强度对比，表明STL1、STL2启动子转入后，产甘油假丝酵母生命力得到加强。