封口处理对保存在silica膜上的人全血DNA质量的影响

张瑞丽，钱云，杨静逸

（云南舜喜再生医学工程有限公司，云南昆明 650106）

脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）是构成染色体的重要组成部分[1]。基因组DNA中含有生物体所有的遗传信息，随着生物技术的发展以及深入的研究，各种基因工程技术已在医药、农业、畜牧等领域中得到广泛的应用[2-3]。

DNA测序技术在医学遗传学的研究中是必要的手段之一。本实验将DNA置于silica膜中保存不同的时间，通过对比保存不同时间的DNA结构完整性，得出DNA在加水立柱中可保存时间，为DNA长途运输极限时间提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样本

抗凝全血样使用EDTA二钠抗凝管采集，并置于4 ℃备用。

1.1.2 仪器及试剂

无核酸污染的Tip头、无水乙醇，生工生物工程（上海）股份有限公司；1 kb DNA Ladder（Dye Plus）和6×Loading Buffer，宝日医生物技术（北京）有限公司；UltrapowerTM核酸染料，北京百泰克生物技术有限公司。

MICROCL 17/17R 高速离心机，美国Thermo Scientific公司；VORTEX-GENIE®2漩涡混合器，美国Scientific Industries公司；单道可调精准移液器，美国RAININ®；AxyPrep血基因组DNA试剂盒，江苏康宁；NanoDrop 2000超微量分光光度计，美国Thermo Scientific公司；G：BOX F3凝胶成像系统，美国Syngene公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人全血DNA提取方法

采用AxyPrep血基因组DNA试剂盒对采集的血液样本进行DNA提取，在silica膜中央加入100 μL的ddH2O洗脱DNA。

1.2.2 DNA浓度及完整性测定

取1 μL的DNA样本用超微量分光光度计测定其浓度和纯度（A260/A280）；取 1 μL的 DNA、0.21 μL的6×Loading Buffer、1 μL的1%核酸染料混合液点样于琼脂糖凝胶进行电泳（1%琼脂糖凝胶，电压120 V，时间40 min），用凝胶成像系统采集图像，检测基因组完整性。

1.2.3 试验设计

分为加封口膜（F）和无封口膜（NF）两组，每组样品分别在24 ℃、相对湿度为54%环境下保存0 d、6 d、10 d、14 d、18 d、20 d、22 d 及 24 d时测定其浓度、完整性及剩余体积，每组设置3个重复，以第0 d作为对照组。每次测完浓度和点样完成，将洗脱至收集管内的DNA样品吸出并重新注入silica膜中央。

1.2.4 数据分析

采用SPSS 21.0对数据进行方差分析[4]，依据琼脂糖凝胶电泳图片判断基因组完整性[5]。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取结果

按照试剂盒使用说明书对新鲜的血液样本进行DNA提取，F组基因组的浓度均值为42.9 ng/μL，NF组为41.3 ng/μL。如图1所示，与DNA Marker片段相比，除样品条带外未出现任何条带，提取样品的DNA片段无断裂、无外源核酸污染、分子大小相同，完整性较好。

图1 新鲜血液的DNA电泳结果

2.2 封口处理对DNA浓度、纯度及剩余体积的影响

2.2.1 DNA浓度

封口处理对DNA浓度随时间变化的影响如图2所示，可以看到随着保存时间的延长，F和NF两组DNA的浓度均呈上升趋势，且NF组上升的速率明显高于F组。

图2 封口处理对不同保存时间DNA溶液浓度的影响

2.2.2 DNA剩余体积及纯度

封口处理对DNA剩余体积及纯度随时间变化的影响如图3和图4所示。从图中可看出，随着保存时间的延长，F和NF组DNA的剩余体积均呈下降趋势，NF组下降的速率明显高于F组，第20 d时，NF组溶液剩余体积已达最低值，F组可持续至第24 d。F组DNA溶液损失程度较小，DNA保存液体积下降速率为12.6%/d，NF组DNA保存液体积下降速率为21.8%/d，较F组损失多。两个处理组的DNA纯度（A260/A280）无统计学差异（P＞0.05）。

图3 封口处理对不同保存时间DNA溶液剩余体积的影响

图4 封口处理对不同保存时间DNA纯度的影响

2.2.3 封口处理对DNA完整性的影响规律

分别将第6 d、10 d、14 d、18 d、20 d、22 d和24 d的DNA电泳结果与第0 d作比较，发现两种处理间DNA完整性在同一时间无差异，3个重复之间无明显差别。第10 d起DNA条带附近出现轻微拖带现象（图5），表明有部分DNA已断裂；第18 d时拖带现象明显，说明DNA降解加重，但仍有明显主带（图6）；第24 d时，拖带现象较第18 d严重，说明DNA降解加剧，此时主带有模糊现象，但仍可见主带（图7）。

图5 封口处理第10天DNA电泳结果

图6 封口处理第18天DNA电泳结果

图7 封口处理第24天DNA电泳结果

3 讨论

基因组DNA由不同的含氮碱基按照碱基配对原则形成序列，构成了控制生物体各种蛋白质合成表达以及物种遗传信息的遗传密码[1]。

对患者进行相关疾病的致病基因检测/筛查，有助于疾病病因的确立并提前示警，通过改善生活习惯和饮食规律来预防和避免疾病的发生[6]。血液作为临床诊断和基础研究中常规采集的样本，具有较大的参考价值。从全血中提取DNA是多种分子生物学实验的第一步，DNA样本提取后若不能及时检测或者检测条件不够必须储藏时，储藏条件对DNA样本的完整性影响值得研究。

由于剩余体积接近最低值终止实验，故本研究未探索至DNA完全降解或降解至不能用于后续实验的时间。研究使用100 μL的ddH2O洗脱DNA，试剂盒最大洗脱体积为200 μL，所以DNA的起始浓度和体积对其在silica膜上室温保存时间的影响有待进一步研究。

4 结论

DNA结构的完整性仅与保存时间有关。随着时间延长，保存在silica膜上的DNA随着体积的减少浓度上升，DNA纯度变化则不显著，DNA在第10 d开始降解，第24 d降解严重但仍有主带，可用于后续测序实验。NF组与F组体积到达最低可检测时分别为保存第20 d和第24 d，说明室温下silica膜上的DNA可至少保存24 d。用于长距离运输时，在收集管口加封口膜可延长保存时间并可避免外源污染。