活细胞在线监测在酵母发酵中的应用

汪运洋，马环，冯潇磊，吴健，杜志勇，马焘，任坤，赵猛

（北京生物制品研究所有限公司，北京 100176）

20世纪80年代，默克（Merck）公司利用改造的酿酒酵母工程菌表达乙型肝炎病毒表面抗原，并通过生物反应器发酵培养制备乙型肝炎疫苗[1]，成为最早应用重组酵母工程菌制备疫苗的成功案例。利用工程菌大规模发酵培养技术获得目的产物，成为了新型疫苗开发的趋势。工程菌大规模发酵生产过程多在生物反应器中进行，通过对生物反应器温度、pH、转速、溶氧、浊度等参数的控制，使微生物的基因表达及代谢调控最有利于目的产物的生物合成和促进目的蛋白的累积[2]。在发酵罐体积相对固定的条件下，活菌数量与细胞代谢、产物合成紧密相关，如果不能全面了解细胞增殖与代谢之间复杂关系的影响因子，就很难重复与控制细胞生产过程和目的产物的合成[3]。因此，本文利用电容法在酵母发酵过程中进行活菌细胞数量的在线监测，并探索发酵过程活菌细胞数量和代谢产物之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

工程菌种及发酵培养基，北京生物制品研究所乙肝疫苗室；ZETA750生物反应器，ZETA公司；INCYTE活细胞数密度监测仪，HAMILTON公司。

1.2 酵母工程菌的扩增

酵母工程菌菌液由北京生物制品研究所乙肝疫苗室提供，于适应温度和时间等条件下经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵培养获得。

1.3 INCYTE-活细胞数密度监测仪的原理

如图1所示，活细胞传感器的检测探头一般分为四针式电极和四环式电极两种，无线电频率在100 kHz～20 MHz，传感器电极会在培养液内产生交叉电场，完整的原生质膜细胞会发生极化，具有类似微型电容器的特性。另外一对电极收集培养液中的电容信号，再经过信号放大器处理、分析计算获得电容值[4]。

图1 活细胞传感仪的电极

1.4 培养过程细胞传感仪监测参数的设定

目前，研究者们已成功在20余种菌体发酵过程中应用活细胞传感器在线采集数据，并根据实验数据建立了菌体浓度的校正模型，不同细胞类型的检测频率、菌体浓度的校正模型和电导率变化范围如表1所示。

表1 不同细胞类型的检测频率、菌体浓度校正模型和电导率变化[5]

使用INCYTE-活细胞数密度监测仪，记录酵母发酵工程菌过程中的电容值变化，参考表1数据进行相应的实验参数设置。首先将仪器电极插入生物反应器监测探头预留孔中，加入发酵培养基后121 ℃灭菌30 min，在发酵培养开始前连接信号放大器进行监测参数设置，电容频率分别设定为465 kHz、578 kHz、680 kHz和 897 kHz，数据记录频次为3 min/次。将酵母工程菌加入生物反应器，在固定搅拌转速、温度、溶氧等参数的前提下，进行酵母工程菌的发酵培养，同时启动浊度探头在线监测OD280。

2 结果与分析

2.1 不同电容检测频率对酵母菌校正模型监测的影响

不同细胞类型检测频率、菌体浓度校正模型可能存在一定的差异，因此本实验选取4个频率同时在线检测，对比不同检测频率下酵母活菌电容值曲线的差异，实验结果如图2所示。从图2可知，4种频率下酵母活菌电容值趋势基本一致，检测值无明显差异。

图2 不同电容频率下酵母活菌电容值趋势图

2.2 发酵过程中OD280趋势检测

分别进行A组、B组重复实验，A组接菌后初始OD280值为4.13，B组接种后初始OD280值为3.51。A组、B组发酵过程OD280检测趋势如图3所示。从图3可知，OD280检测值随培养时间的延长而增加，两组细胞趋势相同，培养结束OD280值略有差异，这与酵母细胞初始接种量差异有关。

图3 发酵过程OD280监测值趋势图

2.3 电容频率680 kHz下电容值监测趋势

以表1酵母菌监测电容频率为参考，本试验选择电容频率680 kHz条件下进行监测，结果如图4所示。从图4可知，酵母活菌电容监测值在发酵培养过程的0～20 h随时间延长而增长，从20 h至培养结束，酵母活菌电容值保持稳定，无明显增长趋势。A组和B组发酵过程中电容值变化趋势基本一致。

图4 电容频率680 kHz下发酵过程电容值监测趋势图

3 结论与讨论

大规模发酵生产中用到的生物反应器，一般通过在线监测温度、溶氧、搅拌转速、OD值、pH值等参数，达到控制或监控生产的目的。在生产中，准确的反应活细胞量对细胞发酵生产过程控制有着非常重要的指导意义。传统的活细胞测定方法依靠取样离线检测，如染色后显微镜计数、流式细胞计数等。取样过程不仅增加了发酵培养基被污染的风险，同时还有操作复杂、检测结果滞后等缺点。

活细胞在线监测电极可与发酵罐同时在线灭菌，无需取样离线检测即可获得发酵过程各阶段准确的活细胞数量，为培养过程活菌数量变化的监控提供高效、科学的监测手段。

本文通过利用电容法在线监测酵母发酵过程活菌细胞数量，初步发现活细胞数量随培养时间的延长逐渐趋于平衡，但OD280值持续增加。说明在有限培养体积和有限培养物质的前提下，控制细胞浓度可以有目的性的选择促进细胞代谢和表达代谢产物的时间，从而为酵母工程菌发酵过程中目的代谢产物的优化控制提供新的思路。