大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒的制备与表征

郭玲，张永萍，徐剑

(贵州中医药大学药学院，贵州省中药民族药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025)

0 引言

大黄酸是一种单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物，为我国传统中药大黄、何首乌等的主要有效活性成分之一[1]，具有抗炎、抗癌、降糖调脂、抗氧化及调节肾功能等药理活性[1]。但大黄酸为不溶于水，脂难溶性药物[2]，生物利用度低，极大限制了其在临床上的广泛应用。

磷脂复合物是磷脂分子和药物分子之间以一定配比关系通过电荷迁移形成的稳定复合物，可改善药物的溶解性能，明显增加药物的体内吸收，改善药物的生物有效性[3]。但药物制备成磷脂复合物后存在黏性大、疏水性强、分散性差等问题[4,5]，限制了制剂学的进一步研究。近年来，越来越多的研究通过将纳米制剂技术与磷脂复合物技术结合应用，以克服磷脂复合物的以上缺陷[6]。人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)为纳米递送系统的常用天然药物载体[7]，具有安全无毒、无免疫原性、组织相容性好等优点。本实验利用大黄酸和磷脂在一定的条件下制备大黄酸磷脂复合物，以HSA为载体采用一种基于二硫键形成的新型制备技术制备大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒，以期为大黄酸新制剂的研发提供思路。

1 材料

1.1 仪器

1260 Infinity 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)； Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析仪(英国Malvern公司)；H-600透射电镜(日本 Hitachi公司)；SB-4200D型超声波细胞粉碎仪(宁波新芝超声设备有限公司)。

1.2 药品与试剂

大黄酸(成都普菲德生物科技有限公司)；人血清白蛋白(四川远大蜀阳药业有限公司)；蛋黄卵磷脂E80、大豆卵磷脂S100(德国Lipoid公司)；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒的制备

取处方量的大黄酸、卵磷脂置圆底烧瓶中，加入适量丙酮，于40℃水浴中搅拌1h，得黄色澄清溶液，旋蒸除去丙酮即得大黄酸磷脂复合物，用二氯甲烷溶解得油相；取处方量的HSA加入纯水溶解，得水相；将油、水两相混合，采用超声波细胞粉碎仪在冰浴条件下超声，旋转蒸发去除有机溶剂，即得大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒溶液。

2.2 处方及制备工艺的优化

通过单因素考察法对磷脂种类、主药/磷脂比例、HSA用量以及超声时间进行筛查，以确定最优处方工艺。由表1可知：与蛋黄卵磷脂E80相比，选用大豆磷脂S100时，制得的纳米粒粒径较小，较均一，因此最终选定的磷脂为大豆磷脂S100；纳米粒粒径在一定范围内随着大黄酸与S100比例的增加而减小，但S100过多粒径反而增大，主药/S100比例在1∶5-1∶10之间均能制备出粒径和PDI较好的纳米粒，最终选择主药/S100比例为1∶5。2%的HSA溶液可以制备出粒径和PDI较好的纳米粒，最终选择HSA溶液浓度为2%；当超声功率为490 W，纳米粒的粒径随着超声时间的延长而减小，超声8min能制备出粒径和PDI较好的纳米粒，故选择490W超声8min。

表1 单因素试验的考察结果

2.3 最优处方及工艺的确定

取大黄酸12mg、大豆卵磷脂S100 60mg，加入丙35mL酮于40℃水浴中搅拌1h，得黄色澄清溶液，旋蒸除去丙酮即得大黄酸磷脂复合物，加入2mL二氯甲烷溶解，得油相；取20%HSA 1mL，加入9mL纯水溶解，得水相；将油相和水相混合，在冰浴条件，超声功率490W下超声8min，旋转蒸发去除有机溶剂，即得大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒溶液。

2.4 纳米粒的粒径、Zeta电位测定

取适量经水稀释的大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒装入激光粒度仪的样品池中，测定其粒径及Zeta电位。纳米粒的粒径为(156.4±9.8)nm，PDI为(0.180±0.015)，Zeta电位为(-13.8±0.97)mV。如图1所示，纳米粒的粒径和电位分布图均呈现较窄的单峰，说明纳米粒的粒径和电位分布较均匀。

图1 大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒的粒径和Zeta电位图

2.5 纳米粒的形态学观察

将纳米粒溶液滴在铜网上，采用2%磷钨酸钠液负染后在透射电镜下观察其形态。如图2所示，纳米粒呈类球形，粒子之间未见粘连和聚集。

图2 大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒的透射电镜照片

2.6 纳米粒的包封率和载药量测定

2.6.1 测定方法的建立

参考文献建立的HPLC法[8]测定大黄酸的含量，将不同浓度的大黄酸标准溶液进样记录峰面积。以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程为：A=76.419C-14.997(R2=0.9995)，线性范围为：0.6～38.4g/mL。

2.6.2 包封率和载药量的测定

取0.2mL新鲜制备的纳米粒溶液，过G50葡聚糖凝胶柱分离纳米粒和游离大黄酸，分离出的纳米粒用甲醇超声破乳，离心取上清经0.22μm滤膜过滤后，用“2.6.1”项下已经建立的HPLC法测定纳米粒中的药物含量(We)。另外再取未过凝胶柱的样品0.2mL，直接加入甲醇破乳，离心取上清经0.22μm滤膜过滤后，同法测定体系中药物总含量(Wt)，计算包封率(We/Wt×100%)[9]。另取等量样品，冻干后称量白蛋白纳米粒干粉的总质量(Wd)，计算载药量(We/ Wd×100%)[10]。计算得大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒的包封率为(90.38±1.78)%，载药量为(4.14±0.16)%。

3 讨论

大黄酸药理活性显著而广泛，但其临床应用受其理化性质限制。本研究结合磷脂复合物技术和纳米技术，成功制备了大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒，有望改善大黄酸水溶性和脂溶性差的问题。本研究采用一种独特的基于二硫键形成的纳米技术——蛋白结合技术制备白蛋白纳米粒[11]，该技术中，HSA既为载体材料又作稳定剂，通过高剪切力(超声、高压均质等方法)产生局部高热以及气穴空化效应使HSA分子中原有的巯基在水不溶性药物液滴周围交联形成新的二硫键[12]，进而将HSA交联在一起形成纳米粒。与传统的白蛋白纳米粒制备技术相比，本技术无需加入常规表面活性剂或化学交联剂，可保留白蛋白的全部生物学特性，同时避免了醛类交联剂残留以及可能造成的不良反应等问题。蛋白结合技术适用于难溶性药物的包载[11]，这就要求药物在与水不相溶的溶剂中有较高溶解度，因此本实验先将大黄酸制备成磷脂复合物以改善其溶解性能，进而提高大黄酸在纳米粒中的包封效率。本研究可为大黄酸新剂型打下基础，下一阶段，笔者将对大黄酸磷脂复合物白蛋白纳米粒的体内生物学性质进行研究，为大黄酸新剂型的研发提供更为完整的实验数据。