响应面法优化红枣发酵酒酿造工艺研究

陈 雅，廉苇佳，韩 琛，阿依加马丽·加帕尔，雷 静

(新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所，新疆吐鲁番 838000)

红枣又名大枣、华枣，是鼠李科枣属植物枣树的果实，原产于我国[1]。在我国已形成新疆、河南、河北、山东、山西、陕西六大红枣主产区，占全国产量的90%以上，是我国的特色果品[2]。红枣富含维生素、氨基酸、黄酮类、皂苷类等多种营养成分，素有“木本粮食、滋补佳品”之称，具有极高的食用和药用价值[3-4]。红枣中多糖、多酚和维生素C具有抗氧化和清除自由基的能力；环磷酸腺苷具有减轻各种化学药物对肝脏损害的作用；皂苷类物质具有抑菌、保肝、降脂、增强机体免疫力等生理功能[5-8]。

近年来，随着我国实施退耕还林的政策，枣树作为退耕还林和防风固沙的重要经济树种，种植面积和产量增长迅速，为农民脱贫增收做出了积极贡献[9]。近30%的红枣因果实小、有碰伤、裂果、成熟度低等问题，被列为“残次枣”，这些残次枣大多被用作动物饲料或者肥料[10-11]，造成了红枣资源的浪费。残次枣虽然失去了商品价值，但仍具有很高的营养成分和加工特性，将其发酵成红枣酒，能保留红枣原有的风味和营养功能成分，具有改善高血压和肝硬化，提高机体免疫力等多种生理功效[12-13]。因此，本研究以残次枣为原料，研究红枣酒发酵工艺参数，从而实现残次枣的综合加工利用，提高红枣的利用价值，以促进红枣精深加工及红枣酒的发展。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：残次枣（品种：灰枣），购买于吐鲁番市托克逊县农户家；白砂糖，新疆中唐糖业有限责任公司。

试剂及耗材：盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、邻苯二甲酸氢钾、乙醇，均为分析纯；果胶酶，上海康禧食品饮业有限公司；焦亚硫酸钾，ESSECO S.R.L.；酿酒高活干酵母(LALVIN EC-1118)，上海杰兔工贸有限公司。

仪器设备：TP-A500 型电子分析天平，美国康州HZ 电子有限公司；打浆机DJ-330，温州市龙湾东霸食品机械厂；控温发酵罐FJG-1、储酒罐，吐鲁番市耀扬金属制品有限公司；制冷设备ICA-20L，上海康赛制冷设备有限公司；酒精计，冀州市耀华器械仪表厂；自动电位滴定仪ZD-2A 型，上海大普仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程[14]

干红枣→清洗→复水浸泡→去核、去皮→破碎打浆→加焦亚硫酸钾→果胶酶酶解处理→调节糖酸→接种酵母→控温发酵→终止发酵→低温澄清→倒灌→陈酿→澄清→杀菌→灌装→成品

1.2.2 单因素实验

（1）不同初始糖度对红枣酒品质的影响

以初始pH 值为3.5、酵母接种量0.03 %、发酵温度18 ℃进行红枣酒发酵，研究不同初始糖度（18 %、20 %、22 %、24 %、26 %）对红枣酒品质的影响。

（2）不同初始pH值对红枣酒品质的影响

以初始糖度22%、酵母接种量0.03%、发酵温度18 ℃进行红枣酒发酵，研究不同初始pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）对红枣酒品质的影响。

（3）不同发酵温度对红枣酒品质的影响

以初始糖度22 %、初始pH 值为4.0、酵母接种量0.03 %进行红枣酒发酵，研究不同发酵温度（16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃）对红枣酒品质的影响。

（4）不同酵母接种量对红枣酒品质的影响

以初始糖度22 %、初始pH 值为4.0、发酵温度20 ℃进行红枣酒发酵，研究不同酵母接种量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）对红枣酒品质的影响。

1.2.3 Box-Behnken中心组合实验设计

在单因素实验基础上，以初始糖度、初始pH值、发酵温度、酵母接种量4 个因素，建立四因素三水平的Box-Behnken 中心组合实验[15]，以红枣酒感官评分为响应指标，响应面分析因素与水平表见表1。

表1 响应面分析因素与水平表

1.3 指标测定方法

1.3.1 酒精度、总糖、总酸的测定

按照GB 15037—2006的方法检测[16]。

1.3.2 红枣酒感官评分评定标准[17-18]

以色泽、澄清度、香气、滋味、典型性5 个方面为指标，对红枣酒感官品质综合评价。由10 名品评人员组成品评小组，进行感官评定，满分为100分，去掉一个最高分和一个最低分后，取其平均分作为感官评分（取小数点后1 位），红枣酒感官品质评定标准见表2。

表2 红枣酒感官评分标准

1.4 数据处理

数据采用Design-Expert 8.0.6 统计分析软件进行响应面实验设计与结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 初始糖度对红枣酒的品质影响

红枣酒发酵过程中由糖转化成酒精，糖度含量越高，产生的酒精含量就越高[19]。由表3可以看出，随着初始糖度的增加，酒精度、残糖量、总酸都逐渐增加。当初始糖度为18 %时，酒精度为9.6 %vol，残糖量为6.8 g/L；当初始糖度为26%时，酒精度达到13.2%vol，残糖量最高为21.4 g/L，是因为糖分过多会增加红枣酒的渗透压，抑制酵母菌的代谢活动，部分糖未能转化成酒精，使残糖较高且口感不佳，感官评分只有78.3分。当初始糖度为22%时，酒精度为11.3 %vol，残糖量为14.7 g/L，总酸为6.9 g/L，且感官评分最高为86.7 分。因此，选22 %作为红枣酒的最适初始糖度。

表3 初始糖度对红枣酒的品质影响

2.1.2 初始pH值对红枣酒的品质影响

由表4 可知，当pH 值为2.5 时，酸度太高从而影响酵母菌的活性，抑制发酵过程，部分糖不能转化为酒精，使得残糖较高，此时红枣酒的酒精度为8.2%vol，残糖量为67.6 g/L，总酸为8.9 g/L。当pH值为4.5 时，易滋生杂菌，抑制酵母菌代谢，使红枣酒的酒精度降低，为10.3%vol，残糖量为34.7 g/L，总酸为5.5 g/L。当pH 值为4.0 时，残糖量最低为13.6 g/L，说明酒精发酵情况良好，糖分几乎全部转化成酒精，此条件下红枣酒无杂菌生成，酒精含量较高，为11.5%vol，残糖量较低，总酸为5.8 g/L，且感官评分最高为89.3 分。因此，选择4.0 作为红枣酒的最适pH值。

表4 初始pH值对红枣酒的品质影响

2.1.3 发酵温度对红枣酒的品质影响

由表5可知，发酵速率随着发酵温度的增加而增加，发酵温度越高，发酵速率越快，反之发酵温度越低，发酵速率越慢。当发酵温度为16 ℃时，红枣酒酒精度9.6%vol，残糖量为48.5 g/L，总酸为5.5 g/L；当发酵温度为24 ℃时，发酵温度较高，加快酵母菌增殖，菌体过早进入衰亡期，不利于糖转化为酒精，导致后发酵不足，此时，酒精度10.8 %vol，残糖量为24.3 g/L，总酸为9.5 g/L；结合感官评分，当发酵温度为20 ℃时，酒精度为11.7%vol，残糖量12.9 g/L，总酸6.5 g/L，感官评分最高为90.8 分。因此，选择20 ℃作为红枣酒最适发酵温度。

表5 发酵温度对红枣酒的品质影响

2.1.4 酵母接种量对红枣酒的品质影响

由表6 可知，当酵母接种量为0.01 %时，酵母菌含量少，导致酵母菌生长代谢缓慢，使酒精发酵速度缓慢，此时酒精度较低为9.6 %vol；当酵母接种量为0.05 %时，酵母接种量较多，酵母菌生长速度加快，但产生的代谢产物破坏酵母菌生存环境，不利于酒精的产生，此时酒精度降低为11.3%vol；当酵母接种量为0.04%时，酒精度为11.6%vol，残糖量为13.8 g/L，总酸6.9 g/L，此时酒体较饱满，感官质量最佳为91.4 分。因此，选择0.04%作为最适酵母接种量。

表6 酵母接种量对红枣酒的品质影响

2.2 响应面实验结果及数据分析

2.2.1 回归模型的建立及方差分析（表7）

表7 响应面实验方案及结果

2.2.2 回归方程拟合及方差分析

采用Design Expert 8.0.6 统计软件对所得数据进行回归分析，结果见表8，对各因素回归拟合后，得到回归方程：Y=91.46+0.36A-0.18B+1.03C-1.54D+0.45AB-0.25AC-0.73AD+0.28BC-0.20BD+0.95CD-2.92A2-1.92B2-2.54C2-3.04D2。

由表8 可以看出，此模型F 值为63.54，P 值＜0.0001，表示拟合获得的模型方程极显著，说明实验方法可靠，可用该回归方程替代实验真实点对结果进行分析。失拟项F 值为3.5，P 值为0.1191＞0.05，表现为不显著，说明回归方程拟合度和可信度均较好，实验误差小。模型中A 的P 值＜0.05 表现为差异显著，C、D 的P 值＜0.01 表现为差异极显著，说明初始糖度、发酵温度、酵母接种量对红枣酒感官评分的影响显著，而B 的P 值＞0.05，表现为不显著；各因素影响感官评分顺序为发酵温度＞酵母接种量＞初始糖度＞初始pH 值。交互项AD、CD的P 值均小于0.01，说明AD、CD 对红枣酒感官评分的影响极其显著。交互项AB、AC、BC、BD 的P值均大于0.05，说明它们对红枣酒感官评分影响不显著。A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，说明A2、B2、C2、D2对红枣酒感官评分的影响极其显著。复相关系数R2=0.9845，说明实验值与模型回归值一致性良好，实验误差小，可以用此模型分析、预测各因素对红枣酒感官评分的影响。

表8 回归模型及方差分析

2.2.3 响应面图分析

根据Design-Expert 8.0.6 统计分析软件获得响应值的3D 曲面图，分析各因素对红枣酒的感官评分的影响及各因素间的交互作用。由图1 可以看出，初始糖度与酵母接种量对红枣酒感官评分交互作用显著，随着初始糖度与酵母接种量的增加，红枣酒感官评分含量逐渐增加，当两个因素增加到一定程度，红枣酒感官评分又逐渐降低，说明过高或过低的初始糖度与酵母接种量都会影响红枣酒感官品质。发酵温度与酵母接种量对红枣酒感官评分交互作用显著，随着发酵温度与酵母接种量的增加，红枣酒感官评分逐渐增加，当两个因素增加到一定程度红枣酒感官评分又逐渐降低，说明过高或过低的发酵温度与酵母接种量都会影响红枣酒感官品质。

图1 各因素交互作用对红枣酒感官评分影响的响应曲面

2.2.4 验证实验

通过所得回归模型对红枣酒发酵工艺条件进行优化，得到最适发酵工艺条件为：初始糖度22.08%、初始pH 值3.99、发酵温度20.3 ℃、酵母接种量0.04 %，得到红枣酒感官评分为91.7384 分。为了验证模型预测的准确性，按照上述条件进行验证实验。鉴于实验的实际可操作性，将工艺条件调整为：初始糖度22.1 %、初始pH 值4、发酵温度20.3 ℃、酵母接种量0.04 %。经过三组重复实验，实际测得红枣酒感官评分平均值为91.5 分，实验结果与模型结果基本一致，所得模型能较准确地预测实际情况。因此，采用响应面分析方法优化红枣酒发酵工艺条件较准确，有实际的应用价值。

3 结论

通过以红枣酒感官评分为响应值(Y)，初始糖度(A)、初始pH 值(B)、发酵温度(C)和酵母接种量(D)为自变量建立回归方程：Y=91.46+0.36A-0.18B+1.03C-1.54D+0.45AB-0.25AC-0.73AD+0.28BC-0.20BD+0.95CD-2.92A2-1.92B2-2.54C2-3.04D2，得到最适红枣酒发酵工艺条件为：初始糖度22.1 %、初始pH 值4、发酵温度20.3 ℃、酵母接种量0.04 %。在此条件下的红枣酒感官评分最大理论值为91.7384 分。实际测得红枣酒感官评分平均值为91.5 分，表明该回归模型具有较好的预测性能，可用于指导生产实践。