西凤酒酒醅发酵过程中挥发性风味物质分析

白莉圆，陈 雪，张 艳，徐 晨，孟勤燕，张永利，闫宗科

（陕西西凤酒股份有限公司，陕西凤翔 721406）

白酒（Baijiu）是一种蒸馏酒，与白兰地、威士忌、伏特加、金酒和朗姆酒并称为世界六大蒸馏酒[1]。白酒含有的主要成分为乙醇和水，挥发性风味物质含量较少，仅占1 %～2 %，但对酒类的风格、香气、口感等品质影响较大[2-4]。因其原料组成、生产工艺存在差异，使得白酒当中的风味物质种类以及含量不同，从而造成白酒风味的不同[5]，可分为清香型、酱香型、浓香型、米香型、凤香型等12种香型[6]。西凤酒作为凤香型白酒的典型代表，以乙酸乙酯为主，己酸乙酯和高级醇为辅，具有醇香秀雅、诸味协调的特点[7]。

白酒中的风味物质主要来自于原料、酒醅发酵及蒸馏和陈放阶段[8]，目前白酒风味物质的研究主要是对各种香型成品酒、基础酒和贮存酒中挥发性风味物质种类、含量及特征风味物质的研究[9-12]，对酒醅发酵过程中风味物质的研究相对较少。顶空固相微萃取气质联用法是目前分析酒类中挥发性物质的常用方法，范文来等[13]应用固相微萃取（HS-SPME）技术测定出固态发酵浓香型酒醅中包含106 种挥发性化合物；赵爽等[14]通过优化HSSPME-GC-MS方法的萃取条件，分析检测到不同时期酒醅中105种挥发性物质；DONG[15]应用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术，在整个麦芽发酵过程中，共检测出47 种挥发性物质；尚柯等[16]采用HS-SPME 结合GC-MS 对酱香白酒第三轮次堆积酒醅挥发性风味物质进行检测与讨论分析，共检测出32种挥发性风味物质。

目前对凤香型白酒酒醅的挥发性成分变化规律尚鲜有报道，本研究以西凤酒圆窖时期的酒醅为研究对象，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）结合主成分分析法（PCA），解析圆窖期不同发酵时间的酒醅中挥发性风味物质成分，为研究酒醅中特色风味物质及西凤酒的发酵机理提供依据，对西凤酒优化工艺、提升品质、增加效益具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品

酒醅样品：取自陕西西凤酒股份有限公司903制酒车间圆窖期重点窖酒醅。

酒醅取样方法：分别按入池0 d、4 d、7 d、10 d、14 d、18 d、22 d 和30 d（出池）时间跟踪取样8 次。使用取样器取样，取样时选择上、中、下层分别取样，注意避开窖池靠窖池壁处，选择中部略靠窖池壁处，然后将三层的样品混合均匀后，分装成3 份，置于-20 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要试剂

丙酸辛酯、L-薄荷醇、氯化钠等。

1.1.3 主要仪器设备

高速台式冷冻离心机、气相色谱质谱联用仪、固相微萃取头、固相微萃取自动进样器（MPS 2）、超声水浴清洗仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的预处理

取酒醅25 g，用50 mL 超纯水混匀后，于冰水浴超声30 min，4 ℃下以10000 r/min 离心20 min。取上清液8 mL 置于20 mL 顶空瓶中，加入3 g 氯化钠饱和。再加入10 μL 混合内标（L-薄荷醇，终浓度为125.41 μg/L），密封后进行下一步萃取。

1.2.2 顶空固相微萃取条件

三相萃取头（DVB/CAR/PDMS，50/30 μm），将萃取头插入至萃取瓶上部的空气部分（注意不能触及液面），50 ℃预热5 min，吸附萃取45 min，将萃取头插入仪器的进样口，250 ℃解吸5 min，同时仪器启动进行样品分析。

1.2.3 气相色谱条件

色谱柱：DB-FFAP（60 m×0.25 mm×0.25 µm）毛细管柱。升温程序：50 ℃保持2 min，4 ℃/min升温至230 ℃，保持15 min。进样量1 µL；不分流进样；进样口和检测器温度均为250 ℃；载气为He，流速2 mL/min。

1.2.4 质谱条件

EI 电离源；离子源温度：230 ℃；电子轰击能量：70 eV；扫描范围：35～350 amu。

1.2.5 定性和定量

定性：将酒醅提取液中的微量成分与标准品的保留时间进行对比，再对比未知化合物与标准物质在NIST 05 a.L 数据库提供的标准离子碎片图，直接添加标准品离子图谱等方法来确认检测到风味化合物，对酒醅中的风味物质定性。

定量：对各风味物质采用内标法进行半定量，利用选择特征离子方法计算各风味物质的峰面积，标准曲线的建立是以各风味物质与内标物面积之比为横坐标，两者浓度之比为纵坐标。

每个酒醅样取3 份样品，在相同的实验条件下进行检测，结果取其平均值。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时间酒醅中挥发性风味物质组成

由表1 可知，不同发酵时间检测的挥发性化合物的种类及含量均存在差异。利用HS-SPMEGC-MS 技术，在西凤酒酒醅中共检测到33 种挥发性风味物质，其中醇类7 种（除乙醇）、酸类7 种、酯类13种、酮类4种、醛类1种、酚类1种。

表1 不同发酵时间酒醅的挥发性成分及含量 （µg/kg）

由表2 可知，0 d 的酒醅中共检测出19 种挥发性风味物质，主要是酯类与酸类；发酵至4 d 时总计检出25 种化合物，醇类物质种类增加，检测出4 种酮类化合物；发酵至7 d 时，酯类物质增加至12 种，检测出1 种酚类物质，此时检测出23 种化合物；发酵至22 d 时，检测出23 种化合物，其中主要是酯类、醇类和酸类化合物；发酵至30 d 时，共检测出20种化合物。在整个发酵周期内，酒醅中均检测出了醇类、酸类和酯类化合物，由此可见这三类化合物对凤香型白酒的独特风味具有重要影响。

表2 不同发酵时间酒醅的挥发性化合物数量统计(种)

2.2 不同发酵时间酒醅中各类风味物质变化规律（图1）

图1 酒醅发酵过程中各类挥发性风味物质含量变化

醇类化合物是白酒香气成分中重要的一类物质，其突出的特点是沸点低、易挥发，起到“助香”作用[17]，少量的高级醇可以衬托酯香，使酒体醇甜、香气更丰满[18]。由图1 可以看出，醇类物质在发酵过程中波动变化，由发酵开始的0.62 mg/kg 增加至结束时的2.35 mg/kg，增加了近3 倍。异戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇在酒醅发酵过程中含量较高，占醇类物质总量的87.0 %，其中又以异戊醇含量最多，具有白兰地香气和辛辣味[19]。

酸类化合物是白酒中重要的呈味物质，具有协调口感、平衡酒味的作用，可以使酒的香气更加柔和饱满[8]。由图1 可知，酸类物质在发酵第0～11 d增加至最大值12.31 mg/kg，之后有所下降后趋于平稳。乙酸、己酸、丁酸在酒醅发酵过程中含量最多，占酸类物质总量的97.5 %，它们在发酵前期增加，中后期下降，可能是由于酸类物质和乙醇发生酯化反应，生成了相应的酯类风味物质。

酯类化合物是白酒中含量最多的一类风味成分，赋予白酒果香和花香[20]，是西凤酒酒醅检测出的种类最多的风味物质，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、棕榈酸乙酯等。酯类物质在发酵过程中不断积累，在发酵22 d 时达到峰值，从发酵开始时的15.05 mg/kg 增大至发酵结束时的50.20 mg/kg，增加了35.15 mg/kg，是发酵开始的3.3 倍。乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯在酒醅发酵过程中含量最多，占酯类物质的95.9 %，具有水果香，是凤香型白酒中重要的呈香呈味物质。综合来看，醇类、酸类、酯类化合物含量的变化情况相似，均是在0～11 d 期间增加，15 d 时下降后又缓慢上升，在30 d 时下降。在西凤酒酒醅发酵过程中，酯类物质含量最高，其次是酸类、醇类物质，酮类、醛类、酚类物质的种类和含量均较低，以上风味物质的种类与含量，形成了西凤酒醇香秀雅、甘润挺爽、诸味协调的典型风格。

2.3 不同发酵时间酒醅中四大酯变化规律（图2）

图2 酒醅发酵过程中四大酯含量变化

随着发酵的进行四大酯变化规律如图2。由图2 可知，乙酸乙酯含量最高，带有果香和酒香，在发酵过程中波动上升，从发酵开始时的9.6 mg/kg 增加至发酵结束时的25.18 mg/kg，增加了1.6倍，在发酵22 d 时达到最大值44.3 mg/kg。乳酸乙酯在发酵0～22 d 期间其含量一直增加，在22 d 时达到最大值28.55 mg/kg，此后略有下降，这是因为随着发酵的进行，乳酸菌成为主要优势菌，酒醅中积累了大量的乳酸和乙醇，使乳酸乙酯大量而快速生成。己酸乙酯在发酵过程中先上升后大幅下降，然后缓慢上升，在30 d时略有下降，从发酵开始时的2.4 mg/kg增加至发酵结束时的5.54 mg/kg，在发酵11 d 时达到最大值21.34 mg/kg。丁酸乙酯含量较低，变化趋势与己酸乙酯相似，其含量从发酵0 d 时的1.54 μg/kg增加至发酵30 d时的2.68 μg/kg。

2.4 不同发酵时间酒醅中挥发性风味物质主成分分析（表3）

表3 主成分特征值及其贡献率

由表3 可以看出，利用主成分分析法共提取了2 个主成分，其中第1 主成分（PC1）的特征值大于1，方差贡献率为49.1 %；第2 主成分（PC2）的特征值大于1，方差贡献率为33.5%，累计方差贡献率达到82.5%（＞80%），表明这2 个主因子能代表8 个酒醅样品中33 种挥发性风味物质82.5 %的信息，因此可以选择这2个主因子进行分析。

在主成分分析中，载荷因子可以反映不同发酵时间酒醅中挥发性风味物质的差异，绝对值越大表明该变量的影响越大。由表4 可知，第1 主成分（PC1）相比于第2 主成分（PC2）在异丁醇、正丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、乙酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、9-十八烯酸乙酯、(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯、乙缩醛上有较高的载荷系数，说明主成分1（PC1）与这些变量有很高的相关性；第2主成分（PC2）在丁酸、戊酸、己酸、辛酸、己酸甲酯、庚酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、4-乙基愈创木酚上载荷值较大，即这些物质对主成分2 体现的风味信息起主要作用。

表4 挥发性风味物质成分载荷矩阵

以主成分1（PC1）为横坐标，主成分2（PC2）为纵坐标，对不同发酵时间酒醅中挥发性风味物质进行分析，结果见图3 和图4。图3 为8 个酒醅样品在主成分1 和主成分2 上的得分分布，图4 为酒醅中挥发性风味物质在主成分1和主成分2上的分布。

图3 酒醅样品主成分分析

图4 挥发性风味物质主成分分析

由图3 可知，0 d、4 d、7 d、15 d、30 d、18 d 酒醅样品整体较为集中，除0 d 外均在x 轴下方，y 轴附近，表明这几个时间点的酒醅中挥发性风味物质较为相似；0 d 样品在第2 象限，位于x 轴上方，离x 轴较近；11 d、22 d 样品分别位于第1、第4 象限，与其他样品距离较远，完全分开，说明这两个时间点的酒醅中挥发性风味物质成分最为不同。

结合图3 和图4 可知，0 d 酒醅样品落在第2 象限，以辛酸为特征风味物质，具有水果香；11 d 酒醅样品位于第1 象限，与己酸甲酯、己酸、戊酸、丁酸、

庚酸乙酯、2,3-丁二醇、戊酸乙酯、异戊醇、丁酸乙酯、己酸乙酯相对应；18 d、22 d 样品位于第4 象限，结合表1 可知，18 d 样品以苯乙醇为特征物质，22 d样品主要与乙缩醛、4-乙基愈创木酚、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异丁醇、乙酸、乙酸丁酯、乳酸乙酯、9-十八烯酸乙酯、(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯相对应。由表1 可知，4 d、7 d、15 d、30 d 酒醅样品中虽没有特征物质，但也含有丰富的挥发性风味物质。

2.5 不同发酵时间酒醅中挥发性风味物质聚类分析（图5）

图5 酒醅样品聚类分析

依据酒醅发酵过程中挥发性风味物质组成，进行系统聚类分析，结果见图5。8 个样品被分为4类，0 d、4 d、7 d 分为一类，18 d、15 d、30 d 分为一类，11 d 和22 d 分别为一类，表明各分类下的酒醅中风味物质组成相关性高。依据分析结果，发酵大体可分为两类，发酵前期0～10 d、发酵中后期11～30 d。

3 结论与展望

利用HS-SPME-GC-MS 法测定西凤酒酒醅发酵过程中挥发性风味物质成分，共检测到33 种挥发性风味物质，其中醇类7 种（除乙醇）、酸类7 种、酯类13种、酮类4种、醛类1种、酚类1种，酯类物质含量最高，其次是酸类、醇类物质。异戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇占醇类物质总量的87.0 %，乙酸、己酸、丁酸占酸类物质总量的97.5%，乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯占酯类物质的95.9 %，乙酸乙酯含量最高，从发酵开始时的9.6 mg/kg 增加至发酵结束时的25.18 mg/kg，增加了1.6倍。

对挥发性风味物质进行主成分分析，选择前2个主成分，累计方差贡献率达82.5 %。结果表明，0 d、4 d、7 d、15 d、18 d、30 d 酒醅样品整体较为集中，11 d和22 d的酒醅样品最为不同，分别包含了10种、13 种特征风味物质。依据聚类分析结果，将发酵分为两类，发酵前期0～10 d、发酵中后期11～30 d。但此研究仅选取了西凤酒一个生产周期内6个生产阶段的其中1 个阶段的酒醅样品进行分析，还需对西凤酒每个生产阶段的酒醅中风味物质进行探究，才可挖掘出西凤酒酒醅中特色风味物质，为探究西凤酒的发酵机理提供依据。